泛素化(ubiquitination)是蛋白翻译后修饰的一种，通过作为信号分子在许多细胞过程中发挥作用，例如膜转运、蛋白质降解和复合体形成。经典的泛素化主要是蛋白底物泛素化，钟鼎生物提供的技术服务主要针对蛋白底物的泛素化。
蛋白是否泛素化以及泛素化的水平，极大程度上影响着蛋白质稳定性、定位、活性以及相互作用的调控，因此泛素化广泛参与了诸如转录调控、信号传导、损伤修复、细胞凋亡等生理过程。在基因功能研究中不可或缺，将泛素化引入到基因功能研究中，更加真实的还原蛋白体内作用机制。
泛素化过程通常需要3种泛素化酶E1\E2\E3的协同作用:即E1 泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme)、E2 泛素偶联酶(ubiquitin-conjugating enzymes)、E3泛素连接酶(ubiquitin-ligase enzymes)。泛素化的大致流程如下图所示, 泛素被泛素激活酶（E1）结合并与ATP反应，形成泛素-AMP复合物。然后，泛素会从泛素-AMP复合物中转移至泛素结合酶（E2）上。 泛素结合酶（E2）将泛素从自身转移到特定的底物泛素连接酶（E3）上。每种底物蛋白质都有对应的泛素连接酶，它们能够与特定的底物相互作用。泛素连接酶（E3）将泛素与底物蛋白质结合，形成泛素化的底物蛋白质。泛素连接可以发生在底物蛋白质的特定氨基酸残基上，最常见的是在底物蛋白质的赖氨酸残基上形成泛素链。泛素化的底物蛋白质会被细胞中的蛋白质酶体降解系统（如泛素-蛋白酶体系统）识别并降解。泛素化标记的底物蛋白质通过与蛋白质酶体的特定受体结合，被引导进入蛋白质酶体进行降解。
如果靶蛋白结合单个泛素分子, 则称为单泛素化; 如果靶蛋白的多个Lys残基同时被单个泛素分子标记称为多泛素化; 而靶蛋白的单个Lys残基被多个泛素分子标记则称为多聚泛素化。 大多数情况，底物蛋白泛素化的形式为多泛素化。钟鼎的技术服务报告中，会使用泛素抗体或者底物特异性抗体对泛素水平进行检测，也可以使用质谱对泛素的具体形式进行解析。
泛素化过程是三级酶促级联反应, 其中E3在靶蛋白的特异性识别以及泛素化系统活性的调控中起着最重要的作用。E3泛素连接酶具有不同的与E2结合方式和泛素转移催化机制，一般分为三大类：RING结构域E3泛素连接酶、HECT结构域E3泛素连接酶、RBR结构域E3泛素连接酶。如下图所示，三种结构的E3酶转移催化形式略有不同，通过分析E3的性质，可以设计不同的泛素化检测方案。
三类E3泛素连接酶催化机制
1、RING结构域E3泛素连接
RING结构域E3通过招募带有Ub的泛素结合酶E2，E3使E2与底物靠近，催化E2将Ub转移到底物的赖氨酸残基上。
2、HECT结构域E3泛素连接酶
HECT结构域E3首先与带有Ub的E2结合，再与E2携带的Ub形成硫酯键共价连接，然后E3将Ub转移给底物，催化底物泛素化。
3、RBR结构域E3泛素连接酶
RBR结构域E3包含两个RING结构域，两个结构域之间以IBR(in-betweenRING)结构域相连，催化底物泛素化时，RING1结构域与带有Ub的E2连接，随后Ub转移到RING2的活性半胱氨酸残基上形成共价中间体，最后RBR催化Ub从RING2结构域转移到底物上。
除此之外，E3连接酶还有U-BOX，F-Box, PHD-Finger等结构域，可以通过分析蛋白的结构域，来判断是否具有E3连接酶活性。
| 服务流程 | 交付数据或材料 | 周期 | 价格 |
| 步骤一、Cell free蛋白表达（E3泛素连接酶，Substrate蛋白底物） | 询价 | ||
| 1、Cell free表达质粒构建 2、无细胞蛋白表达及磁珠富集 3、WB检测 |
1、质粒及克隆菌株 2、2ml无细胞表达磁珠富集产物（该服务不交付纯化后蛋白） 3、实验报告 |
2~3周 周期依据基因长度调整 |
|
| 步骤二、底物蛋白与E3蛋白体互作分析 | |||
| 4、E3蛋白与底物蛋白pull down互作验证 5、WB检测 |
4、实验报告 | 1-2周 | |
| 步骤三、底物蛋白泛素化检测 | |||
| 6、体外泛素化 7、泛素抗体WB检测 |
5、实验报告 （最终的WB图片，可以依据文章要求，自定义泳道排布） | 1~2周 | |
说明：
1、无细胞蛋白表达产物含量极少，大约在20ug，只用于检测，无法交付纯化后的蛋白。如果需要mg级别的蛋白，仍需通过细胞表达来实现。
2、建议先通过pull down验证E3蛋白与底物蛋白体外互作，再进行体外泛素化实验，按照本实验室累积实验数据来看，体外无法互作的蛋白对，泛素化成功率极低。
3、泛素化的WB检测，可以使用泛素抗体检测，亦可使用蛋白的特异性抗体或标签抗体检测，如需增加一种检测方式，需加收1500元/膜。
4、钟鼎生物（乙方）会将实验结果如实反馈给（甲方）客户，如出现与预期相背实验结论，乙方免费重新实验一次以确认实验结论。乙方承诺数据不造假但不承诺一定符合甲方预期，甲方不得以不符合预期为由拒付服务款项。
说明：MYB60是调控下游叶绿素基因的关键转录因子，推测RING类E3泛素连接酶MaBAH1介导MaMYB60泛素化降解，从而减弱MaMYB60对下游叶绿素降解代谢途径的激活效应，通过GST pull down实验能证明两者的相互作用，通过泛素化实验可以进一步验证这一推论。
参考文献：The Arabidopsis U‐box E3 ubiquitin ligase PUB30 negatively regulates salt tolerance by facilitating BRI1 kinase inhibitor 1 (BKI1) degradation
参考文献:Proteasomal degradation of MaMYB60 mediated by the E3 ligase MaBAH1 causes high temperature-induced repression of chlorophyll catabolism and green ripening in banana
相关服务
猜您想看：
