1、E1和E2都是通用的，为什么E3连接酶不能通用呢？

泛素化过程中，涉及的原料有E1\E2\E3\Substrate\Ub\ATP，除了一些非经典的泛素化过程中会调用一些特殊的E2，其中E1泛素激活酶\E2泛素偶联酶 \Ub泛素\ATP都是相对保守的，都可以通用。 而E3泛素连接酶是针对底物蛋白特性的蛋白，目前已发现的E3连接酶有1800多种，也就是说，每一个Substrate底物蛋白都在茫茫蛋白群中寻觅着它专一的E3泛素连接酶。

2、有的案例中会检测E3连接酶的自泛素化现象，这是泛素化实验中必须的步骤吗？

这个不一定是必须的实验步骤，需要先分析E3连接酶的结构，不同的E3结构域，其转移泛素的途径是多样性的，例如HECT结构域的E3连接酶，泛素需要先转移至E3连接酶上，再进一步从E3连接酶转移到底物蛋白。即使没有对应的底物蛋白，我们也可以先检测E3连接酶的自泛素化。特别是体外泛素化实验，检测E3酶的泛素化现象就能判断E3是否具有生物学能功能。反之，遇到Ring结构域的E3连接酶，泛素直接从E2转移至底物蛋白，检测E3的自泛素化，意义不大。

3、使用pull down +LC-MS技术来寻找底物蛋白对应的E3连接酶,如果富集产物列表中存在E3连接酶，是不是可以明确就是底物的E3连接酶？

Pull down assay使用的的是活细胞（或组织）蛋白裂解液，其互作关系和泛素化水平是极其复杂的，最后的质谱分析数据只是管中窥豹，并不能完全呈现全貌，即使质谱列表中存在E3连接酶，可能是间接作用的产物，因此必须进一步验证其互作关系才能得到实验结论。

4、使用酵母双杂筛选到互作蛋白中有E3连接酶，是不是就可以明确这个就是底物对应的E3连接酶了？

如果诱饵蛋白是Substrate蛋白，E3连接酶出现在筛选到的猎物蛋白列表中，那么恭喜您，已经取得了初步成功。
不过，钟鼎生物还是建议通过点对验证和GST pull down进一步验证其互作关系，明确后再进行蛋白泛素化实验。

5、如何获得E3蛋白和底物蛋白?

利用重组表达即可获得蛋白，从成本的角度考量，我们建议您使用原核表达来获得重组蛋白，从活性的角度看来考量，我们建议您参考研究的材料种属，选用亲缘性比较接近的表达体系来获得蛋白。钟鼎生物可提供原核表达、酵母表达、哺乳动物细胞表达、杆状病毒-昆虫细胞表达等多重体系的表达服务，满足您的个性化需求。

6、泛素化实验中，E3蛋白或底物蛋白是包涵体可以继续实验吗？

包涵体蛋白不能直接使用，必须去除变性剂，重新折叠后溶解在不含变性剂的PBS或Tris缓冲液中才能进行尝试。钟鼎生物使用变复性后的蛋白，曾经成功的完成了泛素化实验，但是成功案例极少，不作为方法推荐，条件允许的情况下，请尽量获得上清可溶蛋白用于下游实验。

7、如果无法获得蛋白或得不到可溶蛋白，实验需要怎么继续？

经过多番努力，依然无法获得上清蛋白，又不愿意使用变复性后的包涵体蛋白进行尝试，最糟糕的情况是，甚至包涵体蛋白都无法获得，实验处于停滞状态。钟鼎生物推荐使用无细胞表达体系（cell free模式）进行尝试，虽然蛋白量偏少。

8、用于泛素化实验的蛋白是否要切除标签？

可溶性的蛋白标签有利于改变融合蛋白的疏水性和空间结构， 有利于得到可溶性蛋白，形成正确的空间折叠，一旦切除标签蛋白后，蛋白可能呈现出疏水性而变成不溶成分，反而无法进行下游试验。大量的实验案例表明，携带了标签的重组蛋白，一样可以成功实现蛋白泛素化，因此钟鼎生物不建议去除标签。同时推荐蛋白泛素化实验中加上标签蛋白组作为阴性对照。

9、泛素化实验完成后，如何检测泛素化水平？

目前使用比较多的主要有两种方案，第一种方案使用western blot检测，主要为使用泛素抗体或重组蛋白的抗体来检测、泛素化之后的底物蛋白会因为增加了泛素分子，会显示出大于其分子量的条带，依据泛素化程度的强弱不均，呈现弥散状或者阶梯状的带型。 第二种方案使用质谱法来检测，泛素化后的蛋白通过质谱的数据分析，不仅可以获得泛素化的水平，还可以判断泛素化的位点。文章发表推荐用抗体检测，图片会更加直观。

 

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