本文介绍了蛋白质双向电泳的原理，详细的实验流程以及实验注意事项，有不对的地方，还请斧正。

蛋白双向电泳原理

  双向电泳（two-dimensional electrophoresis）技术是等电聚焦和十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺（SDS-PAGE）凝胶电泳技术的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照蛋白质等电点对蛋白质进行分离），然后再进行SDS-PAGE凝胶电泳（按照蛋白质相对分子量大小对蛋白质进行分离），最后经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。

  等电位聚焦（Isoelectric focusing）是一种根据分子携带的电荷不同来分离分子的技术。蛋白质同时具有酸性基团和碱性基团，在ph值低于等电点时会带有正电荷，在电场中向阴极移动（高于等电点则向阳极移动）。将蛋白质置于有递增ph梯度的凝胶中电泳，蛋白质所带电荷会一直减少，直到蛋白质移动到ph值与其等电点相同的区域。在此处，蛋白质静电荷为0，因此停止运动，最终蛋白质被“聚焦”在ph值和其等电点相同的窄带中

  十二烷基硫酸铵-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，简称SDS-PAGE）是一种根据蛋白质相对分子量大小来对其进行分离的电泳技术。十二烷基硫酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，能够断裂分子内和分子间的氢键，与蛋白质结合后破坏蛋白质的二级结构使其变性，并包覆变性蛋白质，使蛋白质所带负电荷大大超过了蛋白质原有的电荷量，从而消除不同蛋白质间的电荷差异和结构差异，而使蛋白质带有一致的负电荷和一致的形状。此时，蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，蛋白质的迁移率主要取决于它的相对分子量，而与所带电荷和分子形状无关。

蛋白质双向电泳实验流程

1.三氯乙酸-丙酮沉淀法提取蛋白

2.双向电泳分离待测样品

(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL,否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。
(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。
(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶 45min，15W/胶 5-8hr，20℃。

3.银染法对凝胶进行染色

(1)固定：凝胶于含5%冰乙酸和40%甲醇的溶液中过夜固定。也可于含10%冰乙酸和40%甲醇的溶液中慢慢摇晃固定15min。
(2)清洗：凝胶置于35%乙醇中缓慢摇动清洗3次，每次20min。
(3)增敏：凝胶置于0.02%的硫代硫酸钠中增敏2min。
(4)清洗：用去离子水清洗3次，每次5min。
(5)染色：加入0.25%硝酸银溶液染色20min。
(6)清洗：用去离子水清洗2次，每次1min。
(7)显影：用2.5%Na₂CO₃溶液迅速冲洗，至溶液呈暗黄色；之后用含2.5%Na₂CO₃和0.04%甲醛的水溶液显影。
(8)定影：用1.46%EDTA定影10min。
(9)水洗：去离子水洗3次，每次10min，然后将凝胶置于1%乙酸中于4℃保存。

3.凝胶扫描及图像分析

(1)图像扫描：凝胶染色后采用Image scanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。

(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%乙酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster 2D Platinum software软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以最小点面积30，平滑度2为主要参数最大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。

蛋白质双向电泳实验注意事项

1.TCA：TCA有毒性，有刺激性气味，损害呼吸道、眼睛及皮肤，称量时应戴手套及口罩，避免沾到皮肤及吸入，若不慎接触，应立即用大量水冲洗后就医。TCA易潮解，称量时应迅速。

2.PMSF：PMSF有剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，称量时应戴手套及口罩，避免沾到皮肤及吸入，若不慎接触，应立即用大量水冲洗后就医。PMSF溶于异丙醇后置于-20℃长期保存，保存中易析出结晶，用前取出待结晶溶化后再使用

3.甲醛：有刺激性气味，易挥发，其蒸汽强烈刺激粘膜、眼睛，具有致癌性。使用时应戴手套及口罩，在通风橱内操作。

4.甲醇：有毒，能引起失明。DTT：很强的还原性，散发难闻的气味。可因吸入、咽下或皮肤吸收危害健康。当使用固体或高浓度储存液时，戴手套和护目镜，在通风橱中操作。beta-巯基乙醇：可致命，对呼吸道、皮肤和眼睛有伤害。丙酮：对神经系统有麻醉作用，并对黏膜有刺激作用。

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