细胞稳定转染后的检测方法选择往往让人困扰不已，这些方法各有千秋，目的不尽相同。那么鉴定稳定转染又有哪些注意点，本文将会介绍稳定转染的检测方法以及注意事项。

1.mRNA水平的分析

  首先进行mRNA水平的分析，主要是应用RT-PCR的方法。这也是没有目的蛋白抗体时首选的方法。

  在RT-PCR扩增时，要注意设置多种阴性对照和阳性对照。有关阴性对照的分析，RT反应时，至少有下列两种阴性对照：将反转录酶用水代替和不加RNA样品。其余成分同实验管，同时进行反转录反应后，用PCR反应观察能否扩增得到目的片段。前者对照检测RNA基因中是否含有DNA，后者对照检测PCR产物是否是PCR扩增时所产生的引物二聚体。

  有关阳性对照的分析，以含有目的基因片段的质粒DNA (切记加入的是痕量的质粒DNA)作为模板，进行PCR反应。在将PCR产物进行电泳的时候，将实验组、阴性对照、阳性对照同时在一板胶上电泳，最理想的结果是：阴性对照无带而实验组和阳性对照有相应大小的DNA片段出现，且二者位置相当。但是，切记鉴定实验不是就此结束了，还有一个重要的实验：测序！如果不经过测序的验证就直接下定论说细胞里有基因的表达，未免有些武断，若不经测序验证，心中惴惴不已，谈何有信心去做下一步实验。

  如果机体本身也表达所要分析的基因，前面这种分析要面临着严重的挑战。要分清内源与外源的表达，仅仅依靠PCR产物的多少来判断表达水平的变化，是没有说服力的。最好能从表达载体上着手，能从载体上找一段能表达的序列作为扩增的引物。最理想的引物序列横跨载体与目的基因，如某些载体的标签序列。

2.蛋白水平的分析

  最直接的检测方法来自蛋白水平的分析，主要应用Western Blot等方法。同样，也需要设置好一系列的阴性对照和阳性对照。用目的蛋白的抗体，要分清楚内源蛋白与外源蛋白的表达。良好的跑胶条件及后续的操作是必不可少的。当然用载体上标签序列的抗体，如FLAG、HA、His、GFP等，来检测细胞中外源蛋白的表达情况，是另一种最直观、最明了的操作。

  最有说服力的阴性对照，是来自稳定转染空载体的细胞裂解液。阳性对照可用瞬时表达目的蛋白的细胞裂解液，如在293T细胞中表达。但是阳性对照与所要分析的稳定表达细胞系，细胞裂解液的加入量不能在同一水平，有时可能要相差一个数量级，才能达到比较理想的分析效果。如果目的蛋白的表达量低，可用IP来浓缩其表达。

3.其他方法

  其他方法。除上述方法之外，还有别的方法，如原位杂交、免疫荧光、细胞化学、活细胞GFP观察等。这些方法各有千秋，目的不尽相同。如活细胞GFP观察，直接明了，还能知道外源蛋白在细胞中的定位，但前提是外源蛋白的表达量高。常用的直接转入外源基因整合在染色体、逆转录病毒导入外源基因等方法，外源基因的表达量不是很高。活细胞GFP观察的方法可能行不通，也许慢病毒系统所导入的基因行得通。

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