原理：

利用农杆菌将外源基因导入到烟草叶片中进行表达，可以借此进行蛋白的亚细胞定位、蛋白互作(BiFC) 和蛋白的纯化等实验操作。

试剂

0.5 M MES (pH5.6)
10mM MgCl₂
100mM乙酰丁香酮(acetosyingone, AS)

仪器

一次性注射器
恒温摇床
分光光度计

操作步骤

1.挑取转化有表达质粒的农杆菌克隆(菌株: EHA105) 于1ml含有相应抗生素的LB中，28 度摇床250rpm培养24小时;

2.于5ml含有相应抗生素的LB中，加入100ul 0.5 M MES, 2μl 100mMAS,再接种50μl农杆菌菌液，28 度摇床250rpm培养至OD₆₀₀=1.0 (大约12-18小时);

3.4000rpm常温离心10 分钟收集菌体，用10mM MgCl₂ 重悬至OD₆₀₀=1.0，以每毫升菌液加入2μl的比例加入100mM AS,静置3小时以上;

4.取正处于生长旺盛时期(一个月左右，未开花)的本生烟草(Nicotianabenthamiana),用注射器吸入菌液，去掉针头，以手指抵住叶片正面，将菌液从叶片的反面渗透进去，若注射不顺畅，可用针头子时片上制造一个微小的伤口，再将菌液从伤口注入；

5.正常条件下放置，24-48小时即可取样。

注意事项

1)有的文献报道姻草注射前需黑暗处理，有的文献则报道需要持续光照处理，个人经验至少对于蛋白表达这一操作来说不需要任何处理， 正常条件生长即可，但是用于蛋白互作(BiFC) 可能需要特定的条件，可参见BIFC部分;

2)表达载体的启动子一般是35S，若需要特异基因自身的启动子驱动，需考虑水稻与烟草的单/双子叶植物的区别造成的差异;

3)一般情况下，转化后24小时即有蛋白表达，而48小时后会渐渐消失;

4)若需要提高外源蛋白的表达，可用同样的方法制备含有番茄丛矮病毒基因p19超表达载体的农杆菌，与目的基因的农杆菌等量混合后再注射烟草，此方法的蛋白表达时间为注射后3-7天，且可以大幅提高表达量，但是只适用于本生烟草。

5)如果要抽提并纯化蛋白在未用p19的情况下需5-10g烟草叶片，加p19的情况下可以减半。

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