SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量原理

SDS-PAGE是蛋白质分析中最常用的凝胶电泳系统，广泛用于蛋白质混合物的定性分析、纯化监测。

聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺单体、亚甲基双丙烯酰胺交联剂在引发剂四甲基乙二胺和催化剂的存在下室温聚合而成。调整丙烯酰胺浓度和交联度可以有效地改变凝胶的孔径，从而对大多数大分子颗粒起分子筛效应。在外加电场进行电泳时，蛋白质分子在电场中的泳动速度取决于它所带的净电荷的多少、颗粒的大小及形状。由于蛋白质的氨基酸组成不同，等电点不同，在同一pH条件下所带的净电荷不同，利用在同一电场中的迁移速度不同使各蛋白质分子相互分离。

在SDS-PAGE中，向聚丙烯酰胺凝胶电泳体系中加入一定量的十二烷基硫酸钠(SDS)，一般加入量为0.1%。SDS是能与蛋白质强结合的变性剂，能使.蛋白质的氢键、疏水键打开，并定量结合到蛋白质分子上，形成SDS蛋白质复合物。平均1分子SDS结合有2分子的氨基酸残基，SDS与大多数蛋白质的结合比为1.4g SDS/g蛋白质。由于十二烷基硫酸根带负电，电荷量远远超过蛋白质分子的原有天然电荷量，因而掩盖了不同蛋白质之间的原有电荷差异，使荷电互不相同的蛋白质具有相同密度的负电荷。

另外，蛋白质样品在含有F巯基乙醇和SDS的样品缓冲液中煮沸处理后，所有的蛋白质都完全变性，维系二、三级结构的二硫桥被还原，肽链伸展，使空间结构彼此不同的蛋白质具有相同的构象。由于分子筛效应，在聚丙烯酰胺凝胶中电泳，肽链越长，迁移速度越慢，分子量的对数与蛋白质肽链的迁移率之间有线性关系。

因而在SDS-PAGE中，蛋白质分子在电场中的迁移率主要取决于它的分子大小，而与原有的净电荷及分子形状无关，所以可以用来测定蛋白质的分子量。选择聚丙烯酰胺的孔径，在凝胶中将未知蛋白质和一系列分子量标准蛋白质进行电泳，测量每种标准蛋白在凝胶中的迁移距离，根据标准蛋白质的分子量的对数与迁移率之间的关系曲线，测量未知蛋白质的迁移率，从而计算出相应的分子量。

对于任何给定的凝胶浓度，分子量的对数和相对迁移率只在有限的分离范围内呈线性关系。即15%聚丙烯酰胺凝胶中分子量的线性范围为10000~50000;10%聚丙烯酰胺凝胶中分子量的线性范围为15000~70000;5%聚丙烯酰胺凝胶中分子量的线性范围为60000~200000。

必须注意，在SDS-PAGE中分子量的对数和相对迁移率的线性关系仅仅在蛋白质结合有恒定量的SDS比率时才是正确的。对于一些电荷异常或构象异常的蛋白质，如非常碱性的蛋白质、糖蛋白、胶原蛋白，用SDS- PAGE凝胶电泳法测定的分子量结果不可靠。在组蛋白中，由于带正电的氨基酸比例高，减小了整个蛋白质所带的负电荷，迁移比预想的要慢很多。分析电泳结果时要注意，一般至少用两种方法测定，相互验证。

蛋白质的相对迁移率(Rf)=样品迁移距离/指示染料迁移的距离

在实际应用上，SDS-PAGE凝胶电泳法是测定蛋白质分子量的最常用的方法。测定时需要至少3~4种标准蛋白质，各种标准分子量混合物都可使用。应选用分子量分布在未知蛋白质两侧的标准蛋白质。注意，该方法测定的是亚单位肽链的分子量，适用的蛋白质分子量跨度较大(10000~ 300000)，测定方法快速、易于操作，样品用量很少，一次操作可同时测定多个样品，但花费的时间较长。此外，由于测量前沿和样品迁移距离的测量误差，误差较大，对操作的要求较高。

材料

SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量所需材料
(1)丙烯酰胺储液30%丙烯酰胺，0.8%亚甲基双丙烯酰胺，滤纸过滤，4℃密封存放。注意:丙烯酰胺单体是一种神经毒素，操作时要非常小心，在通.风橱中称量，戴口罩和手套。
(2)缓冲液：a.1. 875mol/L Tris-HCl，pH8. 8。    b. 0. 6mol/L Tris-HCl， pH6.8。
(3)10%过硫酸铵(APS)新鲜配置。
(4)10%SDS 室温储存。低温下SDS从溶液中析出，可将试剂瓶在水浴中加热溶解。
(5)四甲基乙二胺(TEMED)
(6) 电泳缓冲液12g Tris, 57. 6g甘氨酸，2.0g SDS，用水配制成2L，无需调pH。
(7)样品缓冲液5. 0ml 0.6mol/L Tris-HCl (pH=6.8)，0.5g SDS, 5. 0g蔗糖，0.25mlp3-巯基乙醇，0.5%溴酚蓝储液5.0ml,用蒸馏水配制成50ml。缓.冲液中的β巯基乙醇的还原力随储存时间下降，通常2周后须重新配制或补加巯基乙醇。
(8)蛋白质染色液溶解在50%甲醇中的0.1%考马斯亮蓝R-250，10%冰醋酸。先将染料溶解在甲醇中，再加水，然后加冰醋酸。必要时用滤纸过滤。
(9)脱色液10%甲醇，7%冰醋酸。
(10)微量加样注射器或微量移液器枪头。

实验方法

SDS-PAGE凝胶电泳法测定蛋白质的分子量实验方法
(1)电泳样品的准备 蛋白质样品与样品缓冲液混合，95~ 100°C加热5min。
①固体样品直接溶解在样品缓冲液中，纯蛋白或简单混合物的浓度为1~0.5mg/ml。复杂样品的合适浓度则需要测定。 ②溶液样品用等体积的两倍样品缓冲液稀释。加人酸性样品后缓冲液由蓝色变为黄色。电泳样品的正确pH很重要，因此对处于pH不接近6.5的强缓冲液中的蛋白质样品，必须先透析。 ③对已经加人样品缓冲液的蛋白质样品，分装冷冻储存- -段时间后，在使用前也必须补加巯基乙醇。
(2)用去垢剂清洁凝胶板，干燥后组装，并用铁夹固定垂直。具体的组装方式根据所用的凝胶槽类型而定。
(3)分离胶的制备
①混合下列溶液，真空脱气30s。     a. 15%凝胶: 8.0ml pH=8.8、1. 875mol/L Tris-HCl， 11.4ml去离子蒸馏水，20. 0ml丙烯酰胺储液，0. 4ml 10%SDS，0. 2ml 10% APS。     b.10%凝胶: 8. 0ml pH=8.8、1. 875mol/L Tris-HCI, 18. lml去离子蒸馏水，13. 3ml丙烯酰胺储液，0. 4ml 10%SDS，0. 2ml 10%APS。 ②加入14ml的TEMED,并迅速轻轻旋转，充分混匀。TEMED引发聚合反应的开始，因此操作应相当迅速。 ③立即将分离胶混合物转移到凝胶框中，小心地加人到两块玻璃板之间。加入量控制在距离加样孔底部lcm处，多余的凝胶不能倒人水池。 ④为确保分离胶的表面平滑，用移液枪头在胶面上非常小心地加入蒸馏水，加入量为超过胶层2mm。因为水和凝胶的密度差异很大，水溶液不会与凝胶混合，而是在表面伸展。或者在通风橱中加入水不溶性的有机溶剂，如异丁醇。⑤凝胶放置待聚合。触摸凝胶板可察觉凝胶形成过程的放热，当清晰看到凝胶和覆盖的水层之间的光折射变化时，表明聚合完成。
(4)浓缩胶的制备
①在分离胶聚合时准备浓缩胶溶液(4℃)， 混合以下溶液: 1.0ml pH=6.8、0.6mol/L Tris-HCl, 7.5ml去离子蒸馏水，1.35ml丙烯酰胺储液，0.1ml10%SDS，0.05ml 10%APS，真空脱气。 ②吸去分离胶面覆盖的水层。 ③加14ml TEMED到浓缩胶溶液中，迅速混匀。用2ml洗涤分离胶表面，吸去洗涤液，加人浓缩胶溶液，插入梳子，放置待聚合。当梳子周围产生折射变化时，表明凝胶已形成，大约需要20min。 ④聚合完成后，小心地拔去梳子，用电泳缓冲液冲洗净未聚合的丙烯酰胺溶液。
(5)加样和电泳
①凝胶框放人电泳装置中，向上槽中注人电泳缓冲液，检查有无渗漏。再在下槽中加入电泳缓冲液，并倾斜装置赶掉凝胶底部的气泡。 ②用微量加样枪头吸取制备好的样品，穿过缓冲液，慢慢释放到加样孔，加样缓冲液的密度会使样品沉到加样孔的底部。通常加样量为5~ 10μl，记录加样的位置。 ③电泳仪接通电源，正确连接电极。恒流30mA进行电泳，直至溴酚蓝到达凝胶的底部，大约需要2.5~3.0h。
(6)凝胶的染色和脱色
①拆除凝胶装置，撬开凝胶板，取出凝胶，去掉浓缩胶，将分离胶放人染色液。 ②振荡染色至少2h。通常采用的考马斯亮蓝染色可检测0.1μg的蛋白条带，也可采用更高灵敏度的银染色。 ③染色后的凝胶用脱色液进行振荡脱色，间隔一段时间更换脱色液，或者在脱色液中放置固体材料(如聚苯乙烯泡沫)吸附洗脱下的染料可加速脱色。
(7)测量标准蛋白质的迁移距离，计算Rf，并和分子量的对数作图，建立标准曲线。
(8)测量未知蛋白质的迁移距离，计算Rf，从标准曲线上求出未知蛋白质的分子量。

要点

(1)根据所研究的蛋白质的大小选择适当的凝胶。典型的分离胶大多使用15%聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质有效分离范围为10000~100000(即凝胶孔径允许分子量10000的蛋白质不受阻碍通过，而分子量100000的蛋白质只能刚刚进人凝胶孔隙)。对于分子量为150000的蛋白质必须采用低浓度大孔径的凝胶。分离分子量范围宽广的蛋白质时，适合采用梯度凝胶。

(2) 凝胶溶液混合后进行脱气，有助于防止溶液中的氧对聚合反应的抑制，建议将脱气作为常规方式。另一种防止氧对聚合抑制的方法是提高催化剂的浓度，但由于聚合为放热反应，释放出的热量会导致凝胶中形成小气泡，尤其在15%的凝胶中比较常见。

(3)将浓缩胶溶液直接小心地加到分离胶的顶部，省略覆盖这一步，可节省时间。

(4) 制备浓缩胶时，用记号笔标出梳孔的底部位置，或在浓缩胶混合液中加人少量的溴酚蓝，使浓缩胶呈淡蓝色，有利于加样孔的辨别。

(5)通过指示剂溴酚蓝可以看到，样品通过浓缩胶时被压缩成一条细带。首次分析未知样品时，应在溴酚蓝到达凝胶底部时停止电泳，因为低分子量的蛋白质和染料的泳动距离接近，继续电泳可能会丢失。如果发现蛋白质位于距分离胶顶部2/3的情况，可以继续电泳30~60min，增大条带的分离，此时染料将跑出凝胶。

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