与常规PAGE相似，电泳缓冲系统和凝胶浓度是影响 SDS-PAGE分离效果的主要因素。

缓冲系统

对于SDS-PAGE，由于SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用，蛋白质的分离仅依据于亚基的分子大小，因此缓冲系统的选择较简单，只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。最常用的缓冲系统为 Tris-Gly缓冲液，其余如 磷 酸 缓 冲 液 （多用于连续电泳）、Tris-醋 酸 盐 缓 冲液、Tris-硼酸盐缓冲液、咪唑缓冲液以及SDS-尿素系统 （用于分离低分子量蛋白样品）。离子强度一般要求比较低，为0.1-0.2mol/L。

SDS-PAGE为阳极电泳，其缓冲系统类似于表1中的常规PAGE阳极电泳。但在凝胶缓冲液中加入0.1%SDS，在样品缓冲液中加1%-2%SDS和1%-6%巯基乙醇（或3%二硫苏糖醇），并加适量溴酚蓝，在电极缓冲液中加0.1%SDS，不连续电泳的凝胶缓冲液和样品缓冲液中还需加适量甘油。

凝胶浓度

由于凝胶浓度决定凝胶孔径大小，而凝胶孔径影响电泳效果 （即凝胶的分子筛效应）。特别是对于SDS-PAGE，由于电泳分离只取决于SDS-蛋白质亚基胶束的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。应根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度（见表1）。

表1 蛋白质分子量范围与SDS-聚丙烯酰胺凝胶浓度的关系
C=2.6%		C=5%
凝胶浓度(T)/%	分子量范围/kDa	凝胶浓度(T)/%	分子量范围/kDa
5 10 15 20	25-200 10-70 ＜50 ＜40	5 10 15 20	60-170 20-100 10-50 5-40

与常规PAGE相似，电泳缓冲系统和凝胶浓度是影响 SDS-PAGE分离效果的主要因素。

  在SDS-PAGE中，由于蛋白质与SDS结合后都带负电，因此是阳极电泳。
  与常规聚丙烯酰胺凝胶电泳相似，SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳也可分为圆盘电泳、垂直平板电泳和水平平板电泳。其中平板电泳较常使用。

  SDS-PAGE一般来说不采用连续电泳方式，因为在SDS-PAGE中蛋白质间不存在电荷密度差异，多采用不连续电泳方式。不连续电泳中蛋白质的分离主要取决于其分子大小和形状。不连续电泳的分离胶可以是均一胶，也可以是梯度胶。

2.SDS-PAGE的原理

  对于SDS-PAGE，由于在电泳体系中加入了十二烷基硫酸钠（SDS）和强还原剂（如巯基乙醇，二硫苏糖醇等），其中SDS作为阴离子去污剂会破坏蛋白质的氢键和疏水相互作用，导致蛋白质构象改变，而巯基乙醇等可以打开蛋白质分子内的二硫键，使其分解为亚基，因此电泳过程中蛋白质的生物活性丧失或减弱，但电泳后可恢复或部分恢复其活性。

  在离子强度低时，主要以单体形式存在的SDS可以与蛋白质结合，生成蛋白质-SDS复合物。由于SDS带有大量负电荷，复合物所带的负电荷远远超过蛋白质原有的负电荷，这使得不同蛋白质间电荷的差异被掩盖。而SDS-蛋白质复合物形状都呈椭圆棒形，棒的长度与蛋白质亚基分子量有关，所以在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳中蛋白只存在分子大小的差别，利用这一点可将不同的蛋白质分开 （分子筛效应），因此SDS-PAGE常用于检测蛋白质亚基的分子量及鉴定纯度。

  与常规PAGE类似，不连续SDS-PAGE对蛋白质的分离除了基于分子筛效应外，还基于其对样品的浓缩效应。

3.SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的实验方法

  样品缓冲液中须含有3～4倍于蛋白质的SDS以及足够断裂二硫键的β-巯基乙醇或二硫苏糖醇，而且蛋白须完全变性展开。由于每克伸展的蛋白质结合1.4ｇ单体SDS，因此通常在样品缓冲液中加1％～2％（10～20g/L）SDS，在凝胶及电泳缓冲液中加0.1%SDS。

制胶

  SDS-PAGE多采用不连续的电泳方式，其制胶方法与常规PAGE的制胶方法基本一致，但由于凝胶中含有SDS，容易起泡，低温下又易结晶析出，因此单体储备液不需抽气，聚合时的凝胶也不适宜在４℃放置。制胶模具的准备也同常规PAGE相同。下面就介绍不连续电泳中的阳极电泳的制胶方法。

（1）凝胶储备液的配制

① 丙烯酰胺储备液T＝30％，Ｃ固定，2.6%～3%。
② 4×分离胶缓冲液 如pH＝8.8、1.5mol/L Tris-HCl缓冲液，含0.4%SDS。
③ 4×浓缩胶缓冲液 如pH＝6.8、0.5mol/L Tris-HCl缓冲液，含0.4%SDS。
④ 10％过硫酸铵溶液（AP）。

注：丙烯酰胺是神经毒剂，应戴手套操作。电泳时的试剂应达到电泳纯，并使用重蒸水配制溶液。

（2）分离胶配方

A液/ml	B液/ml	重蒸水/ml	10%AP/μl	TEMED/μl
x/30×10=ｘ/3	10/4=2.5	10-ｘ/3-2.5	约50	3～5

  根据聚合的快慢来调节AP和TEMED的用量，使凝胶在20～60min内聚合。

（3）制备浓缩胶

制备样品和加样

  5×样品缓冲液：pH＝6.8、0.06mol/L （0.4mol/L）Tris-Hcl缓冲液，含25％（50％）甘 油、2％（10％）SDS、5％ （体积分数）巯基乙醇和0.1％溴酚蓝。

  将蛋白质溶液与5×样品缓冲液以4：1（体积比）的比例混合（如果蛋白质溶液浓度过高，需预先脱盐处理）后，在100℃水浴中加热3～5min，使蛋白质充分变性，再于10000ｒ／min离心5min，取上清加样。

电泳

  电泳缓冲液：pH＝8.3，0.025mol/L Tris-0.192mol/L Gly缓冲液，含0.1％SDS。

1、带有烷基化作用的还原SDS处理：碘乙酸胺的烷基化作用很好的并且长期的保护SH基团，得到较窄的谱带;另碘乙酸胺可捕集过量的DTT，以防止银染时的纹理现象。

染色和检测

（1）考马斯亮蓝法，在SDS-PAGE后，凝胶的固定和染色时间应比常规PAGE的长1倍左右，或用多倍体积染色液染色，以排除SDS的影响。
（2）银染法，在电泳后染色之前，必须将凝胶多次漂洗，以除去SDS。

4.影响分离结果的因素

缓冲系统

  在SDS对蛋白质的助溶作用以及负电荷的包裹作用影响下，蛋白质的分离仅依据亚基的分子大小，因此缓冲系统的选择比较简单，只要利于分离并保持蛋白质的稳定以及不与SDS发生相互作用即可。常用的缓冲系统有 Tris-Gly缓冲液，其余如磷酸缓冲液（多用于连续电泳）、Tris-醋酸盐缓冲液、Tris-硼酸盐缓冲液、咪唑缓冲液以及SDS-尿素系统 （用于分离低分子量蛋白样品）。离子强度一般为0.01～0.2mol/L。

  SDS-PAGE为阳极电泳，在凝胶缓冲液中加入 0.1％SDS，在样品缓冲 液中加1％ ～2％SDS和1％～6％巯基乙醇 （或3％二硫苏糖醇），并加适量溴酚蓝，在电极缓冲液中加0.1％SDS，不连续电泳的凝胶缓冲液和样品缓冲液中还需加适量甘油。

凝胶浓度

  由于凝胶浓度决定凝胶孔径大小，而凝胶孔径影响电泳效果 （即凝胶的分子筛效应）。特别是对于SDS-PAGE，由于电泳分离只取决于SDS-蛋白质亚基胶束的大小，因此凝胶浓度的选择尤为重要。应根据样品中蛋白质的分子量范围选择合适的凝胶浓度

C=2.6%		C=5%
凝胶浓度（T）/%	分子量范围/kDa	凝胶浓度（T）/%	分子量范围/kDa
5 10 15 20	25-200 10-70 ＜50 ＜40	5 10 15 20	60-170 20-100 10-50 5-40

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