规模化纯化蛋白质的关键因素在于产量和成本，纯化过程应尽可能精简，避免人为因素干扰。进行规模化纯化蛋白质时，已经基 本了解目的蛋白、原料、生产方法、产品纯度要求和最终数量等，但是纯化过程 中很多方面可能要重新评估并作出适当的改变。从实验室规模纯化蛋白质向工业 化规模纯化生产蛋白质的扩大，属于工程学的范畴。工厂规模是一次性的，它必须成功。

  以下介绍规模化纯化蛋白质所需遵循的原则，规模化操作过程和优化控制， 以及规模化纯化中遇到的在实验室操作中可能被忽略的问题。

1.基本原则

  （1）合理设计实验方案，在规模化纯化蛋白质过程中，主要步骤通常不超过４-５个。要尽可能多的了解目的蛋白和杂质的物化性质，尽可能早使用高选择性的步骤，尽可能早分离除去数量最多的杂质，在分离纯化的早期一般是浓缩蛋白质并除去水；最后执行特别费时间或成本很高的步骤。：
  （2） 选择适当的发酵系统和发酵条件，发酵过程和蛋白质分离纯化过程是相互影 响的，合适的发酵将有助于发酵产品的分离及蛋白质的纯化。要严格控制、防止 蛋白酶和细菌的污染。
  （3）规模化纯化蛋白质时，还要注意保持蛋白质活性，减少蛋白质变性及失活。选择适 当的操作温度 （尽量在低温下进行操作）、ｐＨ 和泵，可以有效地控制蛋白质的变性。为了避免因为肽酶的作用等因素造成蛋白质降解，要保持比较低的浓度，尽量缩短操作时间。随着规模的扩大，样品溶液浓度要逐步递增，以减少对色谱过程的影响。
  （4）保持清洁和卫生。即使是低水平的微生物污染也会造成很大的麻烦：过滤机、色谱柱寿命的缩短，产品稳定性的降低等。因此，所有设备都要定期进行严格的清洁和卫生工作。

2.主要操作过程

2.1细胞分离

  工业用离心机通常设计成连续进料。细胞在离心机中沉淀越快，在转子中的 保留时间就越短，相应地，离心处理量越大。决定离心机容量的一个主要因素是相关粒子的大小。通过离心操作回收酵母已有很多年，而动物细胞的处理更加复 杂，因为它们很容易破裂，当通过离心系统时，可能会分解产生微小的碎片。大规模分离细菌和细胞碎片最常用的离心机是多层转盘离心机。

  过滤技术（深层过滤，微孔过滤，超滤）常用于固液分离。旋转式真空过滤机是比较常见的一种，已应用于大规模生产酶制剂过程，从发酵液中除去细菌菌体或丝状微生物。膜过滤系统越来越多应用于规模化从发酵液中分离细胞和细胞碎片，在无菌分离的效果方面远好于价格昂贵的离心机。然而，膜过滤的主要缺点是不能处理高浓度细胞，高浓度细胞会明显降低过滤速度。微滤能够截留溶液中非蛋白质的微小物质，而超滤能够截留溶液中的蛋白质。

2.2. 细胞破碎和碎片分离

  对于细胞内蛋白质的分离，需要先有效破碎细胞。通常先收集细胞，然后进行洗涤以除去残留的培养基，对于仅仅由细胞膜包围着的细胞，比如哺乳动物细胞，破碎比较容易，如果存在聚合细胞壁结构（比如微生物细胞），破碎时就会困难些。以下是三种规模化破碎细胞的方法比较。

方法	优点	缺点
均质法	产量可达6000L/h	不适用于高等真菌，产热高容易使蛋白变性、容易污染
研磨法	产量可达2000L/h，适用于细菌与酵母细胞	破碎效率不稳定、容易污染
酶解法	条件温和，损失较少	条件摸索复杂，成本较高

2.3.浓缩

  早期纯化阶段需要将蛋白质溶液浓缩１０-５０倍，以减小过程体积并使随后的操作更容易处理，这在规模化纯化蛋白质时是个重要的必不可少的步骤，超滤 是比较合适的技术，一般采用错流系统。

2.4.色谱分离

  采用色谱技术从粗产品中分离纯化蛋白质，在生产中始终都要慎重操作。经过浓缩后，得到了蛋白质、其他成分（比如类脂物、细胞壁或其他多糖类）、盐 和水的混合液，随后一般经２～４步色谱纯化才能达到所要求的蛋白质纯度。可 以从不同的色谱方法中进行选择，实验室实验结果有参考作用，专家系统也有助 于优化蛋白质纯化的顺序。首先采用典型操作 （如吸附、双水相萃取或盐析沉淀 等）来提高收率，减少纯化步骤，然后采用高效液相离子交换色谱或亲和色谱纯 化蛋白质，得到９９％ （通常情况下９５％～９８％）纯度的产品。经过上述步骤之 后，如果有需要，可进一步采取其他方法以获得超高纯度。

  在设计规模化色谱操作时，要保证色谱过程可以重复，安全性好，能满足卫 生要求，色谱操作过程、设备、环境、厂房的设计也能保障整个操作环节的卫生 要求及安全性，同时方便于色谱过程数据的收集。通常需要综合考虑以下几个因素：操作过程和装置的控制及可靠性，卫生条件的维持，固定投资费用及操作成本等。

  在大规模色谱分离时，由于样品的体积很大，加样时间常常很长，成为分离 过程的限制性因素，此时往往可以采用分批分离的方法，即吸附过程甚至吸附和 解吸过程都不在色谱柱中进行，样品在容器中与离子交换剂充分混合完成吸附， 将上清液除去，然后将吸附了蛋白质的离子交换剂装柱并进行洗脱，或者直接在容器中用阶段洗脱的方法进行洗脱，此方法可以大大提高分离速度，当然也会使 分辨率变低，适合在规模化分离的前期使用。
  离子交换因其具有很高的样品吸附容量，不但在实验室分离中广泛被使用，而且适合于规模化的蛋白质纯化。离子交换剂具有从稀溶液中浓缩蛋白质的能力，也适合于从大体积的样品（如发酵液）中纯化所需蛋白质。对于实验室小规模的制备，体积为500ｍｌ的色谱柱基本能够满足需要，而在工业化应用中，色谱柱的体积可以被放大到１００～２００Ｌ。由于分离的原理和过程是一致的，很明显，根据已经优化好的小规模分离条件，结合放大时的容量因子，可以推测出大规模分离时所需的操作条件。
  放大过程中的原则是，保持色谱操作上样、吸附和洗脱的条件不变，这里包 括样品的组成、离子交换剂的种类、样品介质比（ｍｇ蛋白／ｍｌ离子交换剂）、起始和洗脱缓冲液的组成、ｐＨ和离子强度 等，在此基础上根据样品量放大柱体积、洗脱剂的体积、流速等参数。其中柱体积是随样品体积的增大而线性增大的，并且柱体积的增大主要通过选用内径大的色谱柱来实现，柱高一般不宜有太大的增加，否则会造成分离时间的增加和样品峰宽的加大。至于洗脱剂的体积， 无论采用哪种洗脱方法，也都是随样品体积增加而增加的。色谱操作时的流速有 两种常用的表示方法，即线性流速（ｃｍ／ｈ）和体积流速（ｍｌ／ｍｉｎ）。一般在讨论 离子交换剂的流速特性和动力学时采用线性流速，而在实际操作过程中通过泵直 接调节控制的是体积流速。它们之间的换算关系为：体积流速 （ｍｌ／ｍｉｎ）＝线性 流速（ｃｍ／ｈ）×色谱柱截面积（ｃｍ２）／６０。在放大过程中应保持线性流速不变，而体积流速将随色谱柱截面积的增大而增加。
  以上是基于很多参数不变的前提，但实际上，大规模纯化中有些参数很难做到完全不变，比如样品的成分和样品介质比。通过发酵、动植物细胞培养或者从生物原料提取目的蛋白时，每一批次的样品在组成、总蛋白含量、目的蛋白所占比例等很多方面总是有一定的波动，这会造成色谱柱内离子交换剂上实际吸附的 蛋白数量和组成每次都有所不同，这往往会导致分离的效果发生改变。特别是大规模分离时样品介质比往往较大，就是说，离子交换剂的交换容量已经被利用到很高的程度，此时样品中蛋白质组成和含量发生变化，可能会造成目的蛋白不能 被完全吸附，因此放大过程中，在有效交换容量上应留有一定的余地。大规模分 离中使用的离子交换剂应当具有良好的物理和化学稳定性，基质颗粒通常不宜太小，因为基质粒度的大小与色谱柱内的背景压力直接相关，相同的粒度情况下， 颗粒直径分布均匀有利于保持相对较低的背景压力。另外，由于大规模分离时交换剂用量很大，必须考虑介质的成本。
  在大规模分离中采用的是直径很大的色谱柱，此时如果将样品或缓冲液直接加到交换剂的床面上，是很难保证液流能均匀进入柱床的，所以在柱床的上方设计一个液流分配器，以便采用多口注入方式。
  还要注意上样前必须保证样品溶液和起始缓冲液在ｐＨ和离子强度方面保持完全一致，这可以通过缓冲液交换或者透析等方法来实现。但体积很大的样品显 然无法进行上述操作，此时可以通过对样品进行稀释，直至其与起始缓冲液离子 强度一致，然后再用酸碱调节样品溶液ｐＨ，使之与起始ｐＨ一致。这样，虽然 样品溶液在缓冲物质和盐的组成上与起始缓冲液并不相同，但由于ｐＨ和离子强 度方面的一致性，也能确保目的蛋白吸附在色谱柱上。 新发展起来的适用于规模化的是快速蛋白质液相色谱。ＦＰＬＣ在中等压力条件下工作，比传统色谱分离速度更快，分离效果更好。ＦＰＬＣ在实验室中被广泛接受，在中试和大规模蛋白质纯 化中也显示出了强大的潜力。相比于高压系统（如ＨＰＬＣ），它的一个优点就是 其设备用塑料而非不锈钢制成，可耐任何缓冲液，因而适于分离纯化蛋白质。

您可能对以下内容感兴趣：
    大规模蛋白表达服务    高密度发酵    膜蛋白纯化