蛋白未与填料结合问题解决

目标蛋白如果没有与填料结合，也就是蛋白不挂柱，又该怎么办？如图所示:

通用方法下进行蛋白纯化，S泳道显示蛋白在上清中表达量很高。FT泳道显示蛋白大部分在流出中，且目标蛋白的电泳条带与S无区别。洗脱泳道显示洗脱的蛋白很少，几乎没有。填料泳道显示填料上无目标蛋白，说明蛋白未沉淀在填料上。

原因可能是蛋白标签被自身结构包裹，无法与填料结合接触。所以解决方法就是：

①增加孵育时间：给予蛋白与填料足够的结合时间。

②增加填料体积：增加蛋白与填料之间碰撞几率，从而提高结合效率。

如图所示：

将Ni-IDA填料增加到5mL，4℃孵育3h，再用洗脱缓冲液洗脱，可见， S泳道显示蛋白在上清中表达量。FT泳道显示蛋白明显减少，说明蛋白以及结合到填料上。洗脱泳道显示存在洗脱的蛋白。填料泳道显示蛋白未沉淀在填料上。

当然，此法可以作为洗脱沉淀在填料上蛋白的一种方法。也可以尝试其他层析方法如离子交换，凝胶层析等。

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