植物组织蛋白质的纯化

   植物在蛋白质纯化方面存在--些特殊的问题，使得单位体积蛋白得率比动物或原核生物要低，而且组织的破坏、干扰纯化和具有氧化作用的天然物质的存在会影响酶的活性。谨慎选择材料来源以及恰当的组织破碎方法就显得很重要。一旦蛋白质成为可分离的形式，植物蛋白就可像其他蛋白一样，采用一般的纯化方法进行处理。本节介绍一些关于植物来源蛋白质纯化的情况，同时对于比较重要的植物系统所特有的酶，介绍一些成功的纯化方法。

影响植物组织蛋白质纯化的因素

蛋白质浓度低

  与大部分其他生物不同，植物的大量固体物质并不是蛋白质，而是包括淀:粉、纤维素、果胶和半纤维素以及多酚等在内的其他大分子物质。最初的均质化必须在大量的缓冲液中进行，以便初步过滤。大量的不溶性物质由于凝胶作用或者简单的吸附作用会影响过滤，因此最初只能得到低浓度的蛋白质，需要经过沉淀或浓缩。均质化后硫酸铵沉淀、PEG沉淀对于植物蛋白质很常用。如果采用超滤浓缩，应考虑植物蛋白与膜结合的能力，以免产生负面影响。

蛋白质水解

  植物蛋白质纯化有时会出现蛋白质水解的问题，常伴有初始蛋白质浓度的降低，这可能由于初始步骤操作时间过长，或者存在蛋白酶的作用。植物含有的主要蛋白水解酶类包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，可选用相应的抑制剂。1mmol/L的PMSF适用于丝氨酸蛋白酶的抑制(表1)。

抑制和褐变

   许多植物组织富含氧化酶，它们作用于内源底物，产生活性产物，与酶反应后使其钝化，这可能是植物天然防御机制的一部分。多酚氧化酶存在于许多植物中，如马铃薯、苹果、香蕉和甜菜，从而产生褐变反应，特别是当游离酪氨酸存在时。其他植物如豆类，组织破碎时所大量释放的过氧化物酶也会引起褐变反应。通过除去底物或抑制氧化酶可以减少褐变反应。阳离子树脂(如Dowex1X2)或疏水作用树脂(如Amberlite XAD-2) 可用于去除反应底物。反应抑制剂可以使用硫醇、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，也可选择抗坏血酸(但应注意对均质缓冲液pH的影响)或偏亚硫酸氢钠(表1)

确定植物蛋白种类的直接和间接策略

  蛋白质通过色谱进行分离，并直接分析确定，可认为是直接策略。对于植物i主要考虑的是组织富集和破碎技术。至于色谱材料以及运行条件等因素根据经验与采用其他原料时相似。前面已经提到，植物的最终产率较低，初始蛋白质浓度低，需要浓缩，因而必须考虑浓缩步骤和最终收率。有许多纯化在最后回收阶段失败，主要是由于蛋白质黏附在浓缩膜上，而数量又不足以形成稳定的沉淀，因此经常导致相当数量的蛋白质损失。有的实验室倾向于最后采用氯仿/甲醇沉淀，而不是硫酸铵或三氯乙酸沉淀。如果需要用于蛋白质测序，可以使用反相HPLC，最终产物通过SDS-PAGE测定。如果银染色显示单一条带，可认为是纯的。

  氯仿/甲醇沉淀法和反相HPLC法是蛋白质测序前常用的最后分离方法。氯仿/甲醇沉淀法的具体操作如下。于1体积的样品中加人4体积的甲醇，混合，加入1体积的高纯度氯仿混合，再加入1体积的水，混合，离心形成两相，弃去上层，注意不要破坏两相界面上的白色蛋白质层。再加入3体积的甲醇，混合，离心沉淀蛋白，除去上清液，溶解蛋白于适当溶剂中。反相HPLC法的操作:将蛋白质样品于0.1% (体积分数)的三氟乙酸(TFA)中透析，浓缩以减少体积，利用Aquapore RP 300 C8色谱柱，以含0.1% (体积分数) TFA 的90%(体积分数)乙腈溶液0-0%的梯度进行HPLC,收集蛋白，洗脱的蛋白完全适合于N末端蛋白测序。

  在许多情况下，考虑到活力损失，不允许进行多步柱分离，或者最终产品显示出多条蛋白质条带。此时可以采用间接分析技术，如凝胶电泳法可用于标示目的酶，此方法可在自然凝胶中进行，或者以活性底物类似物，通常为叠氮衍生物标记蛋白。

  含血红素的蛋白可通过280nm和405nm两种波长检测进行纯化，此方法可用于富含血红素的蛋白如过氧化物酶，以及其他一些纯化较为困难的酶，如细胞色素P₄₅₀的纯化，该酶由于需要与NADPH细胞色素P450还原酶重组，还没有直接的分析方法。有时也可利用氢过氧化物作为供体进行测定，或通过与底物和抑制剂的结合谱进行检测。利用这些方法已经纯化了一些细胞色素P₄₅₀(表2)。

   注: HP一氢过氧化物分析; BS-结合谱分析; R-辐射分析; S一光谱分析; OE一氧电极分析;SM-溶解微粒体; AP-丙酮粉; WW-细胞壁盐洗; AS-硫酸铵沉淀; DE一DEAE离子交换; 2P一双相Triton X-114分离; GF-凝胶过滤; HI-疏水作用色谱; RA一红琼脂糖; HA一羟磷灰石色谱; LC一ConA-Sepharose; MP- Mono P色谱聚焦(Pharmacia 公司); MQ一Mono Q (Pharmacia 公司); NG一非变性凝胶电泳。

样品纯化举例

糖代谢酶类

  植物是糖代谢最典型的代表，除了在所有真核生物中发现的分解代谢途径外，它们还能固碳，而且可大量生产结构和储藏多糖。尽管所有卡尔文循环的酶基因都已被克隆，但并不是所有的酶都已纯化得到纯酶(表3)，其中有些酶具有胞液和质体形式，需要区别和分离。目前大多数纯化方法是直接从全细胞匀浆液开始。

   注: R-辐射分析; S一分光光度分析; DG一密度梯度离心; AS一硫酸铵沉淀; CS一叶绿体基质;PG一PEG沉淀; DE一DEAE 离子交换，GF-凝胶过滤; HI一疏水作用色谱; IE一离子交换色谱; MQ一Mono Q (Pharmacia 公司); BS一Blue Sepharose。

  淀粉合成酶、ADP葡萄糖焦磷酸化酶、淀粉合酶和分支酶构成了一条相对较短的代谢途径，但却是重要的商业酶。出于纯化目的，这些酶一般作为可溶性酶处理，但淀粉合酶却是从分离的淀粉颗粒中纯化出来的。负责合成细胞壁多糖的酶难以纯化，部分是由于这些是膜结合酶，任何溶解过程立即会改变其作用的环境而导致酶的变化(表4)。

  注: R一辐射分析; S一分光光度分析; PG一PEG沉淀; SG一淀粉颗粒分离，AS一硫酸铵沉淀;SM一溶解微粒体; BS一Blue Sepharose; DE一DEAE离子交换; HI一疏水作用色谱; HA一羟磷灰石色谱; IF一等电聚焦，GF一凝胶过滤，MQ一Mono Q ( Pharmacia公司); NG一非变性凝胶电泳; RP一反相HPLC。

次级代谢酶类

  植物具有广泛的次级代谢特性，具有很大的商业利益，也是基因操作的目标。虽然通过突变和互补已经分离了基因，但通过蛋白质纯化途径进行基因克隆仍有一定空间。

  次级代谢产物的形成和相互转变很复杂，类黄酮的合成从p-香豆酰-CoA和丙二酰-CoA开始，在生物化学、分子生物学和遗传学方面已有广泛介绍。类黄酮合成途径中，四羟基苯基苯乙烯酮一般不会积累，由苯基苯乙烯酮异构酶转化为一.般的黄酮柑橘黄素，后由二氢黄酮3-羟化酶羟化得到二氢山柰酚，该物质在此途径中处于中心位置，从它开始产生分支，是种间特异性积累黄酮醇和花色苷的基础。类黄酮生物合成中许多酶的纯化方案列于表5中。

  注: S一分光光度分析，R一辐射分析，TC一TLC分析，AS一硫酸铵沉淀，QS一Q-Sepharose; AD一ADP-Sepharose; DL一染料配基离心; GF一凝胶过滤，AC一亲和色谱; HA一羟磷灰石色谱; HI一疏水作用色谱; IE一离子交换色谱; MP Mono P (Pharmacia公司); MQ一Mono Q (Pharmacia 公司)。

  生物碱的生物合成酶主要来源于组织培养。涉及的生物合成酶的纯化方案列于表6。

  注: R一辐射分析; S一分光光度分析; AS一硫酸铵沉淀; GF一凝胶过滤; DE一DEAE离子交换;HA一羟磷灰石色谱: HI一疏水作用色谱; QS一Q-Sepharose; MP一Mono P ( Pharmacia公司); MQ一MonoQ (Pharmacia 公司); AC一亲和色谱(辅酶A)。

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