疏水相互作用与反相层析技术

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  疏水层析是上个世纪70年代开始发展起来的一门蛋白纯化技术,常常与离子交换层析、凝胶过滤层析等蛋白纯化技术配合使用来分离复杂的生物样品。本文将会介绍疏水相互作用与反相层析的原理,常用介质,应用以及常见问题解析

疏水层析原理

疏水层析的原理

  疏水层析在根据蛋白表面疏水性的不同,利用蛋白和疏水层析介质疏水表面可逆的相互作用来分离蛋白,高浓度盐与水分子发生强烈作用,导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少,促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合。

疏水层析的常用介质

介质 说明 特点
辛基琼脂糖凝胶4FF 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,载量为每ml填料结合50μmol正辛烷基。 疏水性中等,适合各种蛋白的分离和纯化。
丁基琼脂糖凝胶4FF 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h,载量为每ml填料结合50μmol正丁烷基。 疏水性最弱,适合含脂族配体的生物分子。
苯基琼脂糖凝胶4FF 载量为每ml填料结合40umol苯基,工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,工作的最大速度是600cm/h。 疏水性最强,载量高,适合含芳香族配体的生物分子的预处理
苯基琼脂糖凝胶CL-4B 工作pH范围为3-13,清洗pH范围为2-14,载量为每ml填料结合40umol苯基,工作最大速度为50cm/h。 疏水性较Octyl弱,适用于分离和纯化对疏水性尚未了解的蛋白。

疏水层析的应用

(1)适合含有芳香基团的大分子的分离纯化;
(2)DNA疫苗的大规模纯化;
(3)从CHO细胞培养液中纯化HBsAg;
(4)可完全取带传统的盐析沉淀工艺,以保持生物分子的生物活性。

疏水层析在蛋白纯化中的常见问题

1.蛋白不结合或不洗脱?

①可能是蛋白在柱子或滤膜上沉淀了,清洗柱子和滤膜,必要的时候更换
②柱子的平衡不完全,重复或延长平衡的时间,保证电导和pH的稳定
③蛋白形成聚团,并且与柱子的结合力很强,考虑更换溶液,降低盐的浓度,并且使用添加剂来减弱疏水相互作用

2.蛋白不洗脱?

①首先考虑盐浓度是不是高了,降低洗脱缓冲液的盐浓度
②疏水作用太强,更换疏水性弱些的或者配基浓度低的填料,也可以使用添加剂来降低疏水作用

3.蛋白的产量达不到预期?

①蛋白被蛋白酶降解了,在样品和缓冲液中加入蛋白酶抑制剂
②考虑蛋白洗脱问题,解决方法见第二条

4.洗脱物中出现填料?

柱子填装的太紧,或者是在填装的过程中介质坏了
看说明书,了解最大操作压力,平衡时不要使用磁力搅拌。

5.目的蛋白的峰与主峰分离的不好?

①柱子的顶端和底端有混合空间,尽可能的调节顶部的适配器到填料顶端,减少一切柱后体积
②次优洗脱条件,比如梯度太抖,流速过高,改变洗脱条件,用缓些的梯度,降低流速

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