1.凝胶过滤色谱法进行蛋白纯化的原理是什么？

  凝胶过滤层析又称凝胶排阻色谱, 分子筛色谱法, 凝胶过滤法等。利用凝胶过滤介质为固定相，根据物料中溶质相对分子质量的差异的液相色谱法。只依据尺寸大小分离，大组分最先被洗提出。色谱固定相是多孔性凝胶，只有直径小于孔径的组分可以进入凝胶孔道。大组分不能进入凝胶孔洞而被排阻，只能沿着凝胶粒子之间的空隙通过，因而最大的组分最先被洗提出来。小组分可进入大部分凝胶孔洞，在色谱柱中滞留时间长，会更慢被洗提出来。溶剂分子因体积最小，可进入所有凝胶孔洞，因而是最后从色谱柱中洗提出。这也是与其他色谱法最大的不同。

2.凝胶过滤色谱法的优缺点

优点	缺点
1.易操作； 2.条件温和,不会使物质变性 3.分离效率高，回收率较高 4.可纯化的蛋白分子量范围宽 5.纯化过程中不需要能引起蛋白变性的有机溶剂	1.分辨率较低，需采用细长柱 2.上样量小 3.上样前需进行浓缩，对标本要求高 4.成本高，不适合工业化生产

3.凝胶过滤色谱的凝胶特性参数有那些？

(1) 排阻极限(exclusion limit) 是指不能扩散到凝胶基质内部中去的最小分子的分子量。(SephadexG-50的排阻极限是30kDa）。

(2) 分级范围(Fractionation range) 它指出了当溶液通过凝胶柱时,能够为介质阻滞并且分离的溶质分子量范围(SephadexG-50, 它的分级范围为1500—30000)。

(3) 吸水量(Water regains) 1g干凝胶所吸收的水分称为吸水量（SephadexG-50的吸水量为5.0±0.3g ）。溶胀率=吸水量×100%。

(4) 凝胶粒径凝胶颗粒一般为球形，其粒径大小对分离度有重要影响（粒径越小，其分离效率越高）。100-200目(50-150μm)

(5) 床体积(Bed volume ) 表示1g干胶在溶胀后所具有的最后体积(SephadexG-50的床体积为9—11ml/g 干凝胶)

(6) 空隙体积(Void volume) 表示填充柱中凝胶粒子周围的总空间即V0(用平均分子量为2000kDa蓝色葡聚糖测出) 。

4.实验流程

过程	注意事项
凝胶过滤介质选择	根据样品属性及凝胶过滤介质分级分离范围来选择
装柱	柱床高度控制在30-60cm
	装填径高比在1：15-1：100
	装填要均匀疏密适当
上样	上样流速要慢
	上样体积影响分离效果
	组群分离（如脱盐）可上样30%，组分分离上样量控制在10%以内
分离	样品进入柱床后，大于介质排阻上限的物质先流出柱床
	在介质排阻范围内的物质，依据分子大小依次由大到小流出。

5.凝胶过滤色谱的操作过程与吸附色谱有那些主要区别？

吸附色谱固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。

6.凝胶过滤色谱主要应用于那些方面？

（1）脱盐及缓冲液的更换：由于蛋白质与盐的分子量相差较大，因此，很容易通过凝胶过滤色谱将二者分开；了更换缓冲液，可将平衡缓冲液和洗脱缓冲液使用需更换的缓冲液，这样，脱盐的同时即可将样品缓冲液进行更换。

（2）分级分离：当目标蛋白大于凝胶的排阻极限，而杂质处于排阻范围内时，容易得到较纯的目的蛋白；但事实上，由于凝胶的孔径具有一定的分布，要想将目标蛋白和杂蛋白完全分开，具有一定的难度

（3）分子量的测定：在凝胶过滤介质的分级范围内蛋白质的分配系数（或洗脱体积）与相对分子质量的对数呈线性关系（KD=a-blgMW），所以，凝胶过滤色谱可用于未知物质相对分子质量的测定。

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