1、无细胞表达系统的工作原理

无细胞蛋白表达是一种体外重组蛋白质表达技术。通过裂解从所选细胞制备的粗细胞提取物。这些提取物包含转录和翻译所必需的所有主要成分，例如tRNA 、RNA聚合酶、核糖体以及延伸、起始和转录所必需的因子。无细胞表达系统通过将细胞提取物与必要的底物（如氨基酸、能量底物、DNA、辅因子、盐和核苷酸等）结合来实现。
然后，DNA自由的转录翻译，整个过程只需要几个小时。在这个开放的系统中，优化和定制不再复杂，取样和处理变得容易。

2、无细胞相比较传统的大肠杆菌表达体系有哪些优势？

	大肠杆菌表达体系	无细胞表达体系
表达模板	质粒	PCR片段或质粒
蛋白大小	大于100kda的蛋白很难表达	可表达高至360kda的蛋白
表达周期	3-5天	4小时-1天
细菌培养	需要	不需要
诱导表达	需要	不需要
成功率	高成功率需要摸索条件	95%以上
表达量	不同蛋白表达量差异大，约30%的蛋白表达量较高	90%以上蛋白表达量较高
包涵体	很难避免	几乎没有
蛋白折叠	正确折叠需要摸索条件	随着翻译过程，正确折叠成自然状态
内源蛋白降解	有	无
密码子优化	较难	容易
膜蛋白表达	无法表达	加入脂质体，正常表达和组装
毒蛋白表达	无法表达	无细胞，毒性作用，正常表达
多蛋白同时表达	无法表达	多个蛋白可以同时在一个体系中表达，并且可以自动组装成与in vivo结构相同的复合体
内毒素	有	无

3、无细胞表达系统的应用

①片段抗体的初筛

基于VHH、scFv抗体的高通量初筛，特别当最终抗体的生产系统为大肠杆菌时更显优势，可以快速、低成本完成所需工作。

②较难表达的蛋白

无细胞表达系统由于不涉及细胞膜等细胞结构，可以在跨膜蛋白、毒性蛋白上发挥一些优势。

③酶活性研究

无细胞体系可以进行蛋白质的高通量微体积表达，表达后可省去烦杂的分离纯化，因此对表达产物的活性测定相对更容易，尤其是对酶的活性研究。

4、无细胞表达有哪些系统，有什么区别？

	大肠杆菌表达体系	小麦胚芽表达体系	昆虫表达体系	哺乳动物表达体系
相对产量	高(mg/ml)	中	中低	低
相对成本	低	中	中	高
磷酸化	无	有	有	有
糖基化	无	核心	核心	哺乳动物
膜蛋白选择	不溶性纳米磷脂盘去污剂	脂质去污剂	天然内体纳米磷脂盘	天然微粒体脂质去污剂

5、无细胞表达能进行复杂的糖基化和其它翻译后修饰吗?

无细胞表达系统可以通过添加糖基转移酶等酶类，实现某些蛋白质的糖基化修饰，但对于复杂的糖基化等翻译后修饰可能有限。糖基化是一种复杂的翻译后修饰过程，涉及到多个酶类和反应步骤。在细胞内，糖基化修饰发生在内质网和高尔基体等细胞器中，需要细胞内的微环境和各种辅助因子来促进。由于无细胞表达系统缺乏这种微环境和辅助因子，因此对于复杂的糖基化等翻译后修饰可能存在限制。

6、无细胞表达的蛋白稳定吗？

无细胞表达的蛋白稳定性存在一些问题。由于缺乏细胞膜的保护，无细胞蛋白表达体系会更容易受到外部条件的影响，如温度、pH、离子浓度等，从而导致蛋白质的不稳定性、聚集和降解等现象。
因此，在无细胞表达系统中，通常需要采取一些措施来提高蛋白质的稳定性。例如，可以优化表达条件，包括温度、pH、离子浓度等，以减少蛋白质的不稳定性。此外，也可以通过添加稳定剂或保护剂来提高蛋白质的稳定性。

7、无细胞表达系统的产物是否需要进行蛋白纯化？

无细胞表达系统是通过将不同类型细胞裂解制备的，这种体系中包含了大量来自细胞裂解物的内源蛋白。因此，在无细胞表达系统中合成的新蛋白是存在于蛋白混合物中的，并非纯蛋白。
如果下游应用需要使用纯化的蛋白，则需要进行蛋白纯化，可以选择在表达蛋白时带上合适的标签，通过标签进行蛋白纯化。如果下游应用是做分子相互作用研究，如小分子pull down、GST pull-down、EMSA等，或是某些蛋白活性的检测，则无需纯化，直接进行下游实验即可。

 

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