试剂名称 | 来源 | Cat.No. |
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DNA Marker 2000 | 钟鼎生物 | ZD02001 |
DNA Marker 2000 | 钟鼎生物 | ZD10001 |
Protein N | 钟鼎生物 | ZD02012 |
His Monster Beads | 钟鼎生物 | ZD02013 |
琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒 | 钟鼎生物 | ZD02017 |
2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye) 高保真酶预混液 | 翊圣生物科技有限公司 | 10154ES |
ClonExpress II One Step Cloning Kit | Vazyme | C112-01 |
PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准 | thermofisher | 26619 |
pCzn Free是由钟鼎生物技术有限公司开发,专门针对无细胞蛋白表达的质粒载体。将目的基因亚克隆构建重组载体,采用HindIII+EcoRI双酶切,NdeI线性化重组载体,极大程度上提高了模板的投入量,提升了蛋白产量,减少杂蛋白。pCzn Free的具体使用方法如下
一、目的基因的pCzn Free模板构建
将编码目的蛋白的ORF序列插入到pCzn Free载体,以构建重组载体。上述重组载体转化E.coli克隆宿主后, 利用Amp抗性筛选单克隆。并最终测序确认,获得阳性单克隆。
二、目的基因pD2P模板的扩增
将上述构建的pCzn Free质粒模板,按照终浓度1 ng/µL , 加入至试剂盒的DNA Amplifier管中(DNA Amplifier需先以330 µL 水溶解),37 ° 静置1 h, 获得重组pCzn Free模板 的 Amplifier 扩增产物。扩增产物的DNA凝胶电泳分析结果,请参见下图。按照终浓度1 ng/µL, 加入至DNA Amplifier 中(DNA Amplifier 需先以对应标示的水溶解;) , 37 ℃混合反应1h, 获得的反应产物Amplified DNA, 即可以1/30的体积比加入以表达目标蛋白。扩增产物的DNA凝胶电泳结果,请参见下图。此方法操作时间短,使用ng级DNA模板,推荐用于快速制备少量(0-90ml)蛋白表达反应所需的DNA。
三、pCzn Free模板的无细胞蛋白表达
将上述pCzn Free质粒模板的Amplifier扩增产物,以1/30(v/v) 加入至加水溶解的NPZoonTM反应体系,混匀并调整总反应体系为10ml。将上述反应液置于一次性水杯、 培养皿、 12孔板或24孔板等容器中混匀,透气膜封口或盖上盖子(不可完全封闭),室温(25°-30°C) 40-220 rpm摇床上反应3h, 即可完成蛋白表达。添加eGFP-tag的目的基因,蛋白表达后,可以通过SDS-PAGE的荧光胶检测,结果如下图:
NPZoonTM反应体系可以生产单体、 二聚体、 异二聚体以及蛋白复合物。
四、纯化流程
含 His-tag蛋白纯化
His-Beads磁珠纯化法:
①Rxn: 1.5 ml 反应液,4 °C 4000 rpm离心3 min, 收集上清;
②Binding: 取10-20µLHis-beads , 用1000µL Binding Buffer 洗涤两次,磁吸收集beads,备用。向上述①上清液中加入洗涤好的His-beads, 充分震荡30sec,置于4°c旋转混合1h。
③Wash: 将孵育后的上述②样品,磁吸收集beads,吸弃上清;再加入1000µL Washing buffer, 充分震荡30sec,磁吸收集beads,吸弃上清;重复Wash共3次;
④Elution: 向beads中加入30-50µLElution buffer, 用枪头吸吹至混匀,静置1min后,磁吸beads,收集Elution上清,即为目标蛋白。
注: a. Binding buffer: 20 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazole, pH 8.0;
b. Washing buffer : 20 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 8.0;
c. Elution buffer: 20 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH 8.0;
五、蛋白质还原及非还原SDS-PAGE分析
①Target Protein的荧光电泳验证:取上述Elution上清液20µL,加入loading buffer, 进行SDS-PAGE电泳,直接观察目标蛋白荧光条带。
②arget Protein的变性电泳验证:取上述Elution上清液20µL,加入含5%-琉基乙醇的5x loading buffer , 95°C加热10min, 进行SOS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250过夜染色,脱色后,观察TargetProtein的变性蛋白条带。
③变性非还原电泳取Elution上清加入5x Loading buffer ,95°C加热10min, 进行SOS-PAGE电泳,考马斯亮蓝R-250染色,观察目标蛋白条带。
注:a. 非还原Sx Loading Buffer: 250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10% W/V SDS, 0.5% W/VBPB(澳酚兰),50%(VN)甘油;
b.还原SxLoading Buffer: 250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10% W/V SDS, 0.5% W/V BPB(澳酚兰),50%(VN)甘油SOmM-琉基乙醇(-Mercaptoethanol);
六、试剂保存建议 Storage
A.试剂盒未启封加水前可室温(<20-25°C) 短期放置,或-20°C长期保存;
B.试剂盒加水重悬混匀后,Rxn试剂可分装保存,尽置避免反复冻融;
C.AMPi 干粉及 Amplified DNA、 pD2P DNA 溶液-20 °C长期保存。
D.试剂盒开封后请及时使用以免试剂失活;避免反复冻融;
E.避免皮肤直接接触试剂或样品。
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