产品清单

试剂名称	来源	Cat.No.
DNA Marker 2000	钟鼎生物	ZD02001
DNA Marker 2000	钟鼎生物	ZD10001
Protein N	钟鼎生物	ZD02012
His Monster Beads	钟鼎生物	ZD02013
琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒	钟鼎生物	ZD02017
2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye) 高保真酶预混液	翊圣生物科技有限公司	10154ES
ClonExpress II One Step Cloning Kit	Vazyme	C112-01
PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准	thermofisher	26619

pCzn Free是由钟鼎生物技术有限公司开发，专门针对无细胞蛋白表达的质粒载体。将目的基因亚克隆构建重组载体，采用HindIII+EcoRI双酶切，NdeI线性化重组载体，极大程度上提高了模板的投入量，提升了蛋白产量，减少杂蛋白。pCzn Free的具体使用方法如下

一、目的基因的pCzn Free模板构建

将编码目的蛋白的ORF序列插入到pCzn Free载体，以构建重组载体。上述重组载体转化E.coli克隆宿主后, 利用Amp抗性筛选单克隆。并最终测序确认，获得阳性单克隆。

二、目的基因pD2P模板的扩增

将上述构建的pCzn Free质粒模板，按照终浓度1 ng/µL , 加入至试剂盒的DNA Amplifier管中(DNA Amplifier需先以330 µL 水溶解），37 ° 静置1 h, 获得重组pCzn Free模板 的 Amplifier 扩增产物。扩增产物的DNA凝胶电泳分析结果，请参见下图。按照终浓度1 ng/µL, 加入至DNA Amplifier 中(DNA Amplifier 需先以对应标示的水溶解；) , 37 ℃混合反应1h, 获得的反应产物Amplified DNA, 即可以1/30的体积比加入以表达目标蛋白。扩增产物的DNA凝胶电泳结果，请参见下图。此方法操作时间短，使用ng级DNA模板，推荐用于快速制备少量(0-90ml)蛋白表达反应所需的DNA。

三、pCzn Free模板的无细胞蛋白表达

将上述pCzn Free质粒模板的Amplifier扩增产物，以1/30(v/v) 加入至加水溶解的NPZoon^TM反应体系，混匀并调整总反应体系为10ml。将上述反应液置于一次性水杯、 培养皿、 12孔板或24孔板等容器中混匀，透气膜封口或盖上盖子（不可完全封闭），室温(25°-30°C) 40-220 rpm摇床上反应3h, 即可完成蛋白表达。添加eGFP-tag的目的基因，蛋白表达后，可以通过SDS-PAGE的荧光胶检测，结果如下图：

NPZoon^TM反应体系可以生产单体、 二聚体、 异二聚体以及蛋白复合物。

四、纯化流程

含 His-tag蛋白纯化

His-Beads磁珠纯化法：
①Rxn: 1.5 ml 反应液，4 °C 4000 rpm离心3 min, 收集上清；
②Binding: 取10-20µLHis-beads , 用1000µL Binding Buffer 洗涤两次，磁吸收集beads,备用。向上述①上清液中加入洗涤好的His-beads, 充分震荡30sec,置于4°c旋转混合1h。
③Wash: 将孵育后的上述②样品，磁吸收集beads,吸弃上清；再加入1000µL Washing buffer, 充分震荡30sec,磁吸收集beads,吸弃上清；重复Wash共3次；
④Elution: 向beads中加入30-50µLElution buffer, 用枪头吸吹至混匀，静置1min后，磁吸beads,收集Elution上清，即为目标蛋白。

注： a. Binding buffer: 20 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 5 mM Imidazole, pH 8.0;
b. Washing buffer : 20 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 20 mM Imidazole, pH 8.0;
c. Elution buffer: 20 mM Tris-HCI, 500 mM NaCl, 250 mM Imidazole, pH 8.0;

五、蛋白质还原及非还原SDS-PAGE分析

①Target Protein的荧光电泳验证：取上述Elution上清液20µL,加入loading buffer, 进行SDS-PAGE电泳，直接观察目标蛋白荧光条带。
②arget Protein的变性电泳验证：取上述Elution上清液20µL,加入含5%􀀃-琉基乙醇的5x loading buffer , 95°C加热10min, 进行SOS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250过夜染色，脱色后，观察TargetProtein的变性蛋白条带。
③变性非还原电泳取Elution上清加入5x Loading buffer ,95°C加热10min, 进行SOS-PAGE电泳，考马斯亮蓝R-250染色，观察目标蛋白条带。

注：a. 非还原Sx Loading Buffer: 250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10% W/V SDS, 0.5% W/VBPB(澳酚兰），50%(VN)甘油；
b.还原SxLoading Buffer: 250 mM Tris-HCI pH 6.8, 10% W/V SDS, 0.5% W/V BPB(澳酚兰），50%(VN)甘油SOmM􀀨-琉基乙醇(􀀨-Mercaptoethanol);

六、试剂保存建议 Storage

A.试剂盒未启封加水前可室温(＜20-25°C) 短期放置，或-20°C长期保存；
B.试剂盒加水重悬混匀后，Rxn试剂可分装保存，尽置避免反复冻融；
C.AMPi 干粉及 Amplified DNA、 pD2P DNA 溶液-20 °C长期保存。
D.试剂盒开封后请及时使用以免试剂失活；避免反复冻融；
E.避免皮肤直接接触试剂或样品。

 

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