摘要

本文介绍了无细胞表达蛋白的案例，通过PCR扩增启动无细胞表达，案例中包含了试验所需的试剂、反应体系以及实验简略流程，仅供参考。

一、试剂和耗材

1.1样品

1例质粒。

1.2主要试剂

试剂名称	试剂来源	Cat.No.
DNA Marker 2000	钟鼎生物	ZD02001
Protein N	钟鼎生物	ZD02012
琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒	钟鼎生物	ZD02017
2×Hieff Canace® Plus PCR Master Mix(With Dye) 高保真酶预混液	翊圣生物科技有限公司	10154ES
PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准	thermofisher	26619
其它试剂均为国产分析纯。

二、主要实验仪器

仪器名称	仪器来源	型号
LifeECO 基因扩增仪	BIOER	TC-96/G/H(b)C
电泳仪	南京普阳	DYY-7C
电泳槽	北京君意	JY-SPCT
凝胶成像仪	Tanon	2500
台式高速离心机	湘仪	H1650-W
台式高速冷冻离心机	湘仪	TGL-16
移液器	Eppendorf	2.5 µl/100 µl/ 200µl/1000 µl

三、实验方法及结果

3.1采用PCR制备目的片段

引物： A：5'﹣GGT.....TAGG﹣3'
B：5'﹣GC....GTG﹣3'
C：5'﹣TAA......GATGCC﹣3'
D：5'﹣TTAT.....GGC﹣3'
E：5'﹣TTC.....TGGAG﹣3'
F：5'﹣CAT.....CGTCCT﹣3'

PCR反应体系如下：

PCR反应程序如下：

PCR反应程序如下：

图1 PCR电泳检测
Fig.1 PCR electrophoresis detection
Lane M：DNA Marker 2000
（从上到下：2000，1000，750，500，250，100）
Lane 1：PIF中间（回收）
Lane 2：阴性

PCR反应程序如下：

图2 PCR电泳检测
Fig.2PCR electrophoresis detection
Lane M：DNA Marker 2000
（从上到下：2000，1000，750，500，250，100）
Lane 1：目标片段
Lane 2：目标片段
Lane 3：目标片段
Lane 4：目标片段
Lane 5：目标片段
Lane 6：目标片段
Lane 7：目标片段
Lane 8：目标片段

电泳检测目的片段为1765bp 切胶回收。

3.2 采用ProteinFactory制造蛋白

1.把纯化好的目的基因加入ProteinFactory 28℃置于摇床110rpm孵育4-6小时。

2.3000xg 10min离心分离包涵体蛋白与上清蛋白。
将蛋白置于-80℃ 待用。

3.3 Western blot检测蛋白

图3 western blot蛋白检测
Fig.3western blo Protein detection
Lane M：PageRuler™ Plus 预染蛋白分子量标准
（从上到下：250，120，100，70，55，35，25，15，10）
Lane 1：无关蛋白
Lane 2：无关蛋白
Lane 3：PIF-2上清蛋白
Lane 4：PIF-1上清蛋白
Lane 5：PIF-2包涵体蛋白
Lane 6：PIF-1包涵体蛋白

四、结果分析

根据WB鉴定结果分析，蛋白分子量与理论分子量一致，蛋白存在断裂。已得到符合要求的蛋白。

 

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