在蛋白表达纯化实验中，我们常常会碰到目标蛋白沉淀在柱子上的情况，如图上所示:

S泳道显示蛋白在上清中表达量很高。FT泳道显示蛋白明显减少，说明蛋白已经结合到填料上。洗脱泳道显示洗脱的蛋白很少，几乎没有。填料泳道显示蛋白基本上都沉淀在填料上，未能洗脱下来。

这里我们提供两种解决问题的方法供大家借鉴：

方法1：

将填料再用洗脱缓冲液含300mM DTT洗脱，洗脱电泳结果如下图所示：

可以看到：柱泳道显示沉淀在填料上的目的蛋白。柱后泳道显示用法1洗脱填料后，明显看出目的蛋白的减少，说明蛋白已洗脱。

洗脱泳道显示存在洗脱的目的蛋白。

小结：此法可以作为洗脱沉淀在填料上蛋白的一种方法，但由于添加了300mM DTT，所以对Ni-IDA填料损伤较大，需要重新再生填料。

方法2：

如图上所示，对实验进行重新设计，可以看到 S泳道显示蛋白在上清中表达量很高，因为破碎料液比的增加，溶液中的目的蛋白浓度有明显的减少。FT泳道显示蛋白明显减少，说明蛋白已经结合到填料上。洗脱泳道显示存在洗脱的蛋白。填料泳道显示蛋白有部分沉淀在填料上，但因为有部分蛋白可以洗脱下来，所以这部分损失可以接受。

此法可以作为洗脱沉淀在填料上蛋白的一种方法。且法1和法2同时使用。

简单总结一下：蛋白沉淀在填料上，主要的原因就是蛋白与蛋白之间聚合，形成蛋白聚合体，从而与填料结合更加紧密。所以解决方法就是： 加300mM DTT洗脱：将聚合蛋白打开，使其成为单体。 加甘油/蔗糖：增加溶液粘度，降低蛋白之间碰撞几率，从而降低聚合概率 降低孵育时间：减少蛋白和填料的结合时间。

当然，如果以上方法都不能解决的话，就直接找我们做吧！

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