在进行重组蛋白表达纯化时，亲和标签的选择至关重要，本文从9个方面，阐述选择亲和标签时需要考虑的因素，仅供参考。

(1)目的蛋白的结构和功能

亲和标签与目的蛋白之间的作用是相互的，需要综合考虑，既要考虑到对目的蛋白结构功能的影响，又要考虑到对标签与其配体亲和作用的影响，以及实际的用途。大多数情况首选短的多肽标签，这是因为短的多肽标签对目的蛋白的结构影响最小，在某些应用中，短肽不必要去除，因为重组蛋白已经具有完全的生物学功能，这也是6个组氨酸标签比GST标签应用更广的原因，而且短肽不具有免疫原性，融合蛋白可直接用于抗体的制备;而大的亲和标签可能限制重组蛋白的折叠，影响蛋白质的生物学功能。从另一方面来讲目的蛋白可能会干扰短肽标签与其配体的结合，与小的短肽标签相比，大的多肽和蛋白质标签也在实验室作为常规选择，它们的亲和配体大多是低分子化合物，可以降低目的蛋白对结合的影响，增强纯化的特异性。在许多情况下，重组融合蛋白去除亲和标签后，目的蛋白可形成正确的结构。

(2)蛋白是否稳定

含有多对二硫键的蛋白质或某些蛋白质在进行非融合表达时，容易形成包含体，或有降解发生。降解的原因有两种情况，一是目的蛋白的不正确折叠，如果加人的亲和标签能够促进目的蛋白的正确折叠，那么就可阻止蛋白质的降解;第二种情况是末端氨基酸不稳定，这时的原则是: N端融合有助于保护目的蛋白的N端，而C端融合有助于保护目的蛋白的C端，从而可以获得全长的目的蛋白。亲和标签对蛋白质包含体的形成可以促进，也可以减少，不同的标签有不同的特性，多数情况还与表达系统相关。如麦芽糖结合蛋白(MBP) 具有分子伴侣样的特性，进行N端融合，常有助于蛋白质的正确折叠和活性蛋白的获得，目的蛋白的MBP融合已成功用于晶体结构的研究。

(3)亲和标签的融合位置

亲和标签可以加在N端、C端，也可以进行串联。在选择融合位置的时候，要考虑所处位置对标签亲和性的影响，如GST适合加在N端，还要考虑融合可能对目的蛋白的影响，如果目的蛋白的C端序列包埋在蛋白质的内部，那么进行C端融合就不合适。多数情况下蛋白质的N端区域对蛋白质的功能不是太重要，所以在N端进行融合标签的融合常常能保留蛋白质的生物学功能。由于N端DNA序列对蛋白质的转录翻译影响较大，所以标签加在N端对蛋白质的表达水平影响更大，优化标签的mRNA结构可使表达水平提高。N端标签对表达蛋白的溶解性影响更大，如在N端使用天然HAT标签比6X His标签有助于目的蛋白的可溶性表达，而N端进行MBP融合表达也常用来提高目的蛋白的溶解性。进行分泌表达时，常选用可分泌的亲和标签，有些亲和标签不适合于放在N端，如6XHis标签放在N端会影响重组蛋白信号肽的处理和目的蛋白的分泌，这是因为6X His标签具有多个带电味唑残基，在选择融合位置时，另一个方面要考虑的是，C端融合表达时在去除融合标签后，在目的蛋白的C端会有几个氨基酸残留:而对于N端融合表达，可以在去除标签后得到完整的天然目的蛋白。

(4)是否需要在变性条件下进行亲和纯化

如果融合蛋白以包含体的形式存在，由于大多数的亲和标签不适于在变性剂存在条件下进行亲和纯化，只能先进行包含体的俗解和复性，再在非变性条件下进行亲和纯化，其中有些亲和标签可以促进蛋白质的折叠复性，如来源于蛋白A的ZZ标签，可使胰岛素样生长因子I (IGF-I) 融合蛋白在比非融合蛋白高100倍的浓度下成功折叠复性，并且不会形成沉淀，在选择亲和表达纯化系统时需要考虑。组氨酸标签在非变性和变性条件下通常均可进行亲和纯化，除了可使用前面的这种方法，还可直接在变性条件下进行亲和纯化或亲和色谱复性，而且亲和色谱复性常常可以提高折叠的效率。

(5)亲和标签对表达水平的影响

亲和标签对表达水平的影响不仅与亲和标签和目的蛋白相关，还与可用的表达纯化系统密切相关，需根据具体情况进行分析。

(6)是否需要标签具有鉴定功能

如果对于 目的蛋白没有方便有效的分析鉴定方法，可选择具有鉴定功能的亲和标签。

(7)亲和洗脱的条件

在下表列出了亲和洗脱的条件，有些条件比较温和，而有些条件较为剧烈，选择的亲和表达系统应该不使目的蛋白变性。

常用的亲和融合表达/纯化系统
亲和标签	分子大小	结合配体	融合部位	洗脱条件	注释
谷胱甘肽巯基转移酶(GST)	26kD(220aa)	谷胱甘肽	N端	还原型谷胱甘肽	载体: pGEX、pET41、pET42，可进行表达蛋白的检测，融合蛋白形成二聚体
金葡菌蛋白A(Protein A) IgG结合结构域	30kD	hIgG	N端	低pH	载体: pRIT2T,具有Protein A信号序列可进行分泌表达，可在弱变性条件下纯化(0.5mol/L盐酸胍)
ZZ结构域	14kD	hIgG	N端	低pH	载体: pEZZ18,具有Protein A信号序列可进行分泌表达，可使目的蛋白获得正确的折叠
链球菌蛋白G(Protein G)	28kD	白蛋白(HSA)	N端或C端	低pH	具有Protein G信号序列可进行分泌表达
白蛋白结合结构域( ABD)	5~ 25kD	白蛋白(HSA)	C端	低pH
几丁质结合结构域	52aa	几丁质	N端或C端	诱导剪切	pTYB, pTWIN
纤维素结合结构域(CBD)	107aa,114aa,156aa	纤维素	N端或C端	麦芽糖	载体:pET 34、pET 35、pET 36、pET 37、pET 38，可增强表达蛋白的热稳定性,具有信号肽序列可进行分泌表达
麦芽糖结合蛋白(MBP)	41kD(396aa)	直链淀粉	N端或C端	麦芽糖	载体:pMAL,具有MBP信号序列可进行分泌表达，可改善溶解性
PinPoint(可生物素化蛋白)	13kD	单体抗生物素蛋白	N端	生物素	载体: PinPoint,可进行表达蛋白的检测
Biotin Avitag(可生物素化的短肽)	15aa	单体抗生物素蛋白	N端或C端	生物素	载体:pAN、pAC,可进行表达蛋白的检测，可进行目的蛋白的固定化，可在变性条件下纯化
Strep tag II(非生物素化亲和素)	8aa	链霉抗生物素蛋白变体Strep-Tactin	N端或C端	脱硫生物素	载体: pPR IBA, pASK-IBA,具有OmpA信号序列可进行分泌表达，可进行表达蛋白的检测，可进行目的蛋白的固定化，可在变性条件下纯化
钙调蛋白结合肽（CBP）	26aa	钙调蛋白	N端或C端	EGTA/EGTA和1M NaCl	pCAL
组氨酸标签（Poly His）	6aa、8aa、10aa、18aa	螯合金属离子Ni2+或Co2+	N端或C端	咪唑/低pH	载体: pET、pHAT、pQE、pProEx、pTrcHis,可在变性条件下纯化
表位标签FLAG	8aa	单抗M1/M2	使用M1单抗进行N端融合，使用M2单抗N端或C端融合	融合蛋白与M1单抗的结合是钙依赖的；使用EDTA，M2单抗是非钙依赖的；使用低pH或合成的FLAG肽	载体:p-FLAG、p3×FLAG,已具有肠激酶酶切位点
S标签	15aa	RNase A的S片段	N端或C端	低pH	载体:pET,可进行表达水平的监测
T7标签	11aa	单抗	N端	低pH	载体:pET,可增强表达水平，可在弱变性条件下纯化
精氨酸标签(Poly Arg)	5~ 15aa	强酸性阳离子基团	C端	氯化钠梯度
苯丙氨酸标签(Poly Phe)	11aa	疏水苯基	N端	乙二醇

(8)是否在亲和纯化后去除标签

融合蛋白是否需要去除标签，由目的蛋白的用途和标签的特点来确定，如果用于免疫动物生产抗体，则不需要;如果不影响蛋白质的功能研究，也不需要;如果影响了蛋白质的功能研究或用于临床治疗，则需要去除标签。

(9)成本因素

亲和介质和缓冲液的费用。

以上就是我们分别从目的蛋白的结构和功能、蛋白稳定、亲和标签的融合位置、是否需要在变性条件下进行亲和纯化、亲和标签对表达水平的影响、是否需要标签具有鉴定功能、亲和洗脱的条件、是否在亲和纯化后去除标签、成本这九个方面，列出的蛋白纯化需要考虑的一些重要因素。

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