Folin-酚试剂法，也称检测法，最早是由Lowry确定蛋白质浓度测定的基本步骤，以往在生物化学领域中广泛应用。

1.Lowry法原理

Lowry 法的显色原理是根据双缩脲反应，蛋白质中的肽键在碱性条件下与Cu2+反应，生成紫红色Cu+复合物。Folin-酚试剂在Cu+的催化下，磷钼酸磷钨酸盐被蛋白质中的芳香族氨基酸残基还原，产生深蓝色的钼蓝和钨蓝混合物，其最大吸收峰在745~750nm处。在一定的浓度范围内，所形成蓝色的深浅与蛋白质含量之间有线性关系，可用于蛋白质含量的测定。

由于产生的混合物的蓝色强度部分取决于酪氨酸和色氨酸含量，而它们在各种蛋白质中含量不同，因此会随不同的蛋白质而出现显色深浅的变化。通常用于酪氨酸和色氨酸的定量测定和蛋白质的相对浓度测定。

由于Folin试剂的主要成分为磷钥酸和磷钨酸，试剂仅在酸性pH条件下稳定，而还原反应又只在pH=10~10.5范围内发生，因此在进行测定时，Folin-酚试剂加到碱性的铜-蛋白质溶液中，必须立即混匀。此外，Folin试剂的配制较为困难，近年来逐渐被考马斯亮蓝法取代。

在Lowry法中，由于加入Folin- 酚试剂强化了双缩脲反应，使得显色量增加，检测灵敏度提高且比较恒定，因而被广泛应用于不同环境中的蛋白质混合物或粗提物的测定。

通常测定范围是20~250μg,最低可检测5pg的蛋白含量。检测灵敏度范围在5~100μug/ml。

2.Lowry法所需材料

(1)复合物形成试剂 试剂: a, 2% Na₂CO₃溶液; b. 1% CuSO₄●5H₂O溶液; c. 2%酒石酸钠钾溶液。使用前将三种试剂a: b: c以100: 1 : 1 (体积比)混合配制而成。

(2)1mol/L的Folin试剂配制较为困难，可购买商品化试剂。

(3)标准蛋白4mg/ml的牛血清蛋白储液，-20°C保存。用蒸馏水稀释制备系列浓度的标准蛋白稀释液(0μg/ml， 10μg/ml， 20μg/ml， 50μg/ml, 100μg/ml，200μg/ml, 500μg/ml, 1000μg/ ml, 2000g/ml)。

3.Lowry法实验方法

①向0.1ml的样品(或标样)中加人0. 1ml的2mol/L NaOH，沸水浴水解10min。对于沉淀物样品，采用2mol/L NaOH溶解沉淀，沸水浴水解10min后，取0.2ml水解液。对于整个细胞或其他复杂样品需要经过适当的预处理后进行Lowry分析。

②水解液冷却到室温，加1ml新鲜配置的复合物形成试剂，室温放置10min。时间无需严格控制，在几小时内，不会影响最后的吸光度。由于Lowry反应的pH必须维持在10~10.5，所以在处理非此pH范围内的待测样品时要很小心。

③加0.1ml Folin试剂，用旋涡混合仪混合，室温放置30~ 60min。Folin试剂在碱中不稳定，必须充分混合，这对结果的重复性也非常重要。加入试剂20~ 30min后呈色达到饱和，此后每小时颜色信号减弱1%，因而放置不要超过60min。

④若蛋白质浓度低于500μg/ml时，在750nm读取吸光度;若蛋白质浓度在100~ 2000μg/ml时，550nm 测定吸光度。

⑤根据标准蛋白质稀释液的浓度和相应的吸光度绘制标准曲线，测定样品的吸光度，建议测定2~3份平行样，来计算样品蛋白质的浓度。

注意，高浓度时标准曲线非线性，应控制待测样品的浓度在标准曲线的线性范围内。

4.Lowry法要点分析

(1)蛋白质的Lowry测定法专一性较差，干扰物质较多而且影响大。

①表10.2列出了Lowry测定法中部分干扰性物质的效应，干扰性物质主要包括缓冲液、药物、核酸和糖类、EDTA等。低浓度尿素(0.5%)、 硫酸钠(1%)、硝酸钠(1%)、 三氯醋酸(0.5%)、 乙醇(5%)、 乙醚(5%)、 丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，均需作校正曲线。

表1 Lowry测定法中部分干扰性物质的影响

含50μg BAS和下列物质的样品	Lowry法检测的BAS/μg		含50μg BAS和下列物质的样品	Lowry法检测的BAS/μg
	水空白校正	干扰物空白校正		水空白校正	干扰物空白校正
对照:50μg BSA水溶液 0.1mol/L HCl 0. 1mol/L NaOH 1.0mol/L NaCl 1.0%SDS 0.2%叠氮化钠 0.02%叠氮化钠 1 00mmol/L EDTA 50mmol/L EDTA 10mmol/L EDTA 50mmol/L EDTA,pH= 11.25 1.0%辛基葡萄糖苷沉淀 40%蔗糖 10%蔗糖 1%蔗糖 0.2mol/L山梨糖醇 0.2mol/L山梨糖醇,pH= 11.25 20%硫酸铵沉淀 10%硫酸铵 3%硫酸铵 10%硫酸铵,pH=11	50.00 44.20 50.60 50.20 沉淀 49.20 49.50 138.50 96.70 33.60 72.30 沉淀 4.90 42.90 48.40 63.70 68.60 沉淀 沉淀 21.20 32.60	—— 43.80 50.60 50.10 沉淀 49.00 49.60 5.10 沉淀 6.80 12.70 5.00 28.90 41.10 48.10 31.00 26.60 沉淀 沉淀 21.40 32.80	4.0mol/L胍基盐酸 3.0mol/L脲 1.0% Triton X-100 1.0% Brij35 1.0% Lubrol 1.0% Chaps 1.0% Chapso 0.5mol/L Tris 0.25mol/L Tris 0.1mol/L Tris 0.25mol/L Tris, pH=11.25 0.1mol/L碳酸氢铯 100mmol/L葡萄糖 50mmol/L葡萄糖 10mmol/L葡萄糖 1.0mol/L甘氨酸 1.0mol/L甘氨酸,pH=11 2.0mol/L醋酸钠,pH=5.5 0.2mol/L醋酸钠,pH=5.5 1.0mol/L磷酸钠 0.1mol/L磷酸钠	沉淀 53.20 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 10.20 27.90 38.90 40.80 沉淀 68.10 62.70 52.60 7.30 32.50 5.40 47.50 7.30 46.60	沉淀 45.00 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 沉淀 8.80 28.10 38.90 40.80 沉淀 61.70 58.40 51.20 7.70 27.90 3.30 47.60 5.30 46.60

②在蛋白质浓度高的情况下，通过稀释到有效检测浓度可以将干扰效应降到最小。如果无法用稀释减少干扰时，应选择恰当的空白。

③当测定的蛋白质溶液浓度低于1.0μg/ml，可在检测前通过沉淀将样品从干扰物质中分离出来，去除干扰物的影响。沉淀操作:加0.1ml 0.15%脱氧胆酸盐到1.0ml蛋白样品，混合在室温下放置10min，加0.1ml 72%的TCA，混匀，(1000~3000) g离心30min，倾去上清，沉淀用2mol/L NaOH溶解。除去干扰的同时蛋白样品被浓缩，再测定稀释液中的蛋白质。

④由去垢剂、蔗糖和EDTA引起的干扰可通过在Lowry试剂中添加SDS来消除。

(2)用改良的Lowry测定法能提高反应的灵敏度。Folin试剂加到两个组分中，分别混合，灵敏度可提高20%;加人Folin试剂后3min，再加人DTT，灵敏度可以提高50%。

(3) Lowry检测法反应速度慢，所需时间较长。采用微波炉改良操作可进行快速分析，而且形成线性的标准曲线。

微波Lowry检测方法如下:在聚苯乙烯管中，混合样品与Lowry检测试剂;将样品置于全塑料试管架上，放于微波炉中央，旁边放置一烧杯，杯中装有一定体积的室温水，使微波室内的液体总体积为100ml;在微波最高设置下辐射10s;在750nm下测定样品的吸光度，并根据标准曲线确定蛋白质的浓度。

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