包涵体蛋白表达与复性常见问题解析

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1.如何尽量避免蛋白表达过程中包涵体的形成?

(1). 包涵体的形成很大一部分原因是蛋白表达过快引起的,那么降低诱导温度,例如25–30°C,或降低IPTG浓度(0.01–0.1mM)并延长诱导时间,或者换用作用较弱的启动子,以此来减缓表达的速度
(2). 用自诱导培养基来替换IPTG诱导
(3). 携带大标签如GST、 TrX共表达来增加可溶性
(4). 分子伴侣

2.包涵体纯化包括哪些步骤?

(1) 菌体的破碎:首先通过细菌裂解离心得到粗制包涵体;
(2) 包涵体的洗涤:然后使用含有低浓度变性剂(如2M尿素)或不含变性剂的缓冲液清洗包涵体,去除一部分杂蛋白,通过离心得到精制包涵体;
(3) 溶解:再使用含有高浓度变性剂(如8M尿素或6M盐酸胍)的缓冲液对精制包涵体进行溶解;
(4) 复性以及纯化:复性操作方式主要分为稀释、透析和柱上复性,可以先纯化再复性,也可以先复性再纯化;而柱上复性是在蛋白复性的过程中即对蛋白进行纯化
(5) 检测分析:最后,对得到的样品进行检测分析,看是否得到天然态的蛋白。

3.包涵体蛋白复性效率低的原因是什么?

(1). 复性环境与复性过程不匹配
(2). 缺少必要的分子伴侣和折叠酶
(3). 中间体裸露的残基容易彼此结合

4.6M的盐酸胍溶解包涵体,然后用SDS-PAGE检测,跑胶很慢是什么情况?

盐酸胍样品的离子强度很高,而离子浓度对局部的电流肯定影响比较大,用8M Urea 10倍稀释盐酸胍包含体增溶液,再试试

5.复性好的蛋白透析更换缓冲液时,蛋白都析出怎么办?

(1). 可能会是梯度透析间隔时间太短,试着加长一下每次更换溶液的间隔时间。
(2). 要是目标蛋白中含有二硫键的话,透析液中也必须添加一定比例的GSSG/GSH以协助二硫键的正确形成,这在蛋白质重折叠过程中是至关重要的。
(3). NaCl的浓度可再加大一点,因为它也是协助复性过程中常用的复性添加剂。
(4). 实在不行的话,可能还要想办法向透析液中加入其它能够抑制聚集同时协助复性的其它添加剂,如L-Arg、有机溶剂、PEG等。

6.变性剂(离液剂),去垢剂,表面活性剂溶解包涵体的分子原理分别是什么?

  强的变性剂如尿素(6-8M)、盐酸胍(GdnHCl 6M),是通过离子间的相互作用,打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键,使多肽伸展,一般来讲,盐酸胍优于尿素,因为盐酸胍是较尿素强的变性剂,它能使尿素不能溶解的包涵体溶解,而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化,特别是在碱性pH值下长期保温时。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等是去垢剂,可以破坏蛋白内的疏水键,也可溶解一些包涵体蛋白质。另外,对于含有半胱氨酸的蛋白质,分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂,如巯基乙醇、二硫基苏糖醇(DTT)、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸。对于目标蛋白没有二硫键某些包涵体的增溶,有时还原剂的使用也是必要的,可能由于含二硫键的杂蛋白影响了包涵体的溶解。

7.变性的融合蛋白可以制备多抗或者单抗吗?

  变性蛋白的本质还是天然蛋白,用来免疫动物具有更强的抗原性。只是天然蛋白中被包在内部的抗原决 定簇也会暴露出来,如果用该变性抗原制备的抗体来检测变性抗原是可以的,如果用来检测天然蛋白,可能会 有假阳性。做单抗也可以,同样道理,筛选出的单抗可能对抗的抗原决定簇处于天然抗原的内部,是否能用还 要看将来该单抗的用途。

8.包涵体蛋白制备抗体需要复性吗?

  做抗原得到蛋白的话不需要复性。包涵体蛋白就可以了。因为抗体是针对蛋白表位的(各个肽段),而不是功能。
  除了一种情况就是蛋白空间构象导致某些表位的产生,但是这个情况特殊的很,通常情况不需要考虑的。

9.包涵体纯化后收率很低,如何优化?

  蛋白复性后浓度低,可能是在复性的过程中发生了降解。可以将复性好的蛋白浓缩跑胶看看。影响蛋白折叠收率的因素有温度、添加剂和氧化还原剂:
  温度:高温时复性的速率比较高,但是易于发生聚集,一般建议复性的起始温度可以尝试15℃;添加剂:添加剂可以促进结构形成,增强蛋白之间的相互作用,提高溶解性,抑制聚集体的形成,降低侧链的相互作用,如去垢剂,精氨酸,低浓度的尿素和盐酸胍,PEG等;氧化还原剂:对于需要形成二硫键的蛋白来说,还需要使用一些氧化还原剂,帮助复性,形成正确的二硫键,常用的还原剂如DTT,β-ME等。
  包涵体复性是一个十分复杂的过程,受诸多因素的制约。实验中各种试剂和蛋白质的浓度、操作温度和复性时间、缓冲液的成分和pH值等因素都对实验结果有着至关重要的作用。精确掌握每一个因素,才能获得良好的实验结果。