利用取代、插入或缺失克隆基因或DNA序列中的一个特定的碱基，这种体外特异性改变某个碱基的技术，叫作定点诱变（site-directed mutagenesis）。通过这种技术获得的蛋白质突变体有助于进行酶的催化机理、底物特异性以及酶稳定性的研究。

1.定点突变的方法

在目前而言，定点突变技术已经成为了一项分子生物学常规实验技术，对于靶DNA定点突变不仅仅希望在5'末端，也希望在靶DNA的中心或3'末端进行，这就需要利用PCR进行定点诱变法。目前已有商品化的定点突变试剂盒可用于进行克隆于质粒DNA序列的特定位点诱导突变。实验过程简便快捷，不需要用到特殊的M13单链DNA载体和甲基化步骤。利用该试剂盒可以诱导某个已知基因的特定碱基进行定点突变或恢复突变、密码子插入或缺失等实验操作。

定点突变试剂盒的操作步骤十分简单，原则上分为四步。

第一步:制备质粒的靶DNA与掺入了突变碱基的引物结合;

第二步:利用高保真DNA聚合酶对引物进行延伸，形成含有切口的环状双链DNA;

第三步:利用Dpn I限制性酶消化甲基化的非突变的DNA模板，仅仅留下突变并含有切口的环状双链DNA;

第四步:将含有切口的环状双链DNA转化大肠杆菌，在大肠杆菌内环状双链DNA的切口修复形成突变体质粒。

为了保证定点突变准确高效的完成，应注意以下几个方面：

(1) 引物设计通常的引物长度为25~45个单核苷酸，建议引物长度为30~35个单核苷酸;突变位点应该设计在引物的中央位置，一般来说都是以要突变的碱基为中心，再加上两边的一段序列，两边长度至少为11~12个单核苷酸，如两边引物太短，可能造成引物不能和模板稳定配对。

(2) 引物延伸 当引物和质粒都准备好之后，随后应进行PCR扩增，这里注意不能用普通的DNA聚合酶和聚合反应缓冲液，因为我们现在做的PCR是要把整个质粒扩增出来，延伸长度可能长达好几个kb,应该使用扩增长片段的缓冲液。试剂盒适用于15kb及以上的模板突变，但是当所用的质粒模板大于10kb时，白色菌落数量会减少，不过这不会影响突变效率。

(3)突变质粒的选择 PCR反应结束后，应该设法选择出产生了突变的质粒DNA.去除未产生突变的质粒DNA.以降低转化后未突变的本底量。通常做法是采用Dpn I酶处理，该酶可以识别甲基化位点，并将其进行酶切。试验中使用的大肠杆菌菌株(如DH5a)是dam+型菌株，因此提取出来的质粒一般都处于甲基化保护状态，而PCR产物都是没有甲基化保护的，所以Dpn I酶可以特异性地切割模板(质粒)而不会影响PCR产物，从而除去未突变的模板，留下突变的PCR产物，所以提取质粒时的那些菌株一定不能是甲基化缺陷型的菌株。Dpn I酶处理的时间至少在1h以上，最好为2~3h，如果模板消化不够彻底，经过转化后，未突变的菌落就会在平板上长出来。如果突变率较低，可能是质粒加入量过多造成的，可以通过适当延长反应时间或增加Dpn 1酶的用量加以改进。

(4) PCR产物转化与切口填补 PCR反应后的质粒DNA上有切口，将经过Dpn I酶消化后的产物，也即突变后的含有切口的质粒DNA转化进人大肠杆菌中，切口可以被细胞内的连接酶填补。

(5) 平板上为长出单克隆菌落可能是PCR反应体系问题，可以通过对PCR产物进行电泳验证反应体系是否正常。如果确定是PCR反应体系问题，可以通过调节退火温度来解决;也可能是感受态细胞转化效率不够高，可以通过检验感受态细胞转化效率来改进。

2.蛋白质定点突变的检测

蛋白质定点突变是生物工程重要技术，通过定点突变对蛋白质进行改性的产品在应用前需要进行突变点分析和产品鉴定。其困难在于，从很长的蛋白质多肽链中找出一小段含有突变位点的短肽进行分析，保证突变位点发生在设计的突变点上。

采用蛋白质工程技术使天然蛋白质发生突变，是获得高活性低毒活性药物的重要途径之一，但是如何确定突变点是否正确是基因产品质量控制的一项重要内容。 通常采用酶切质谱法分析突变点，这种方法主要是根据突变前后含有突变点的肽段的分子量的变化来进行的，首先根据蛋白质的序列选择合适的裂解试剂或蛋白酶，将蛋白质裂解后再测定突变后的肽质量指纹谱，并与突变后的理论肽谱进行比较，找到含突变点的肽段，最后与突变前的相应肽段的分子量计算值进行比较，如果两者相差为突变氨基酸分子量差的总和，则可判断突变点正确。合适的裂解试剂是相当重要的，因为在较低分子量范围内，质谱的准确度分辨率可以更高，从而使分子量差异的比较更为可靠，但是过多的小片段的产生有可能得不到含突变点的肽段，因此在进行裂解前领仔细分析蛋白质的完整序列，尤其是与突变点相关的肽段序列，并据此选择最恰当的裂解试剂，有时选用几种裂解方法进行相互验证是很有必要的。

采用酶切质谱法进行结果处理时，必须注意以下几点:

(1) 计算突变前后蛋白质的分子量，并与实测值比较，如果误差大于仪器的固定误差，则说明序列结构可能不正确或者存在其他未知的突变、修饰，须查明原因并重新制备蛋白质样品。肽段分子量=氨基酸残基质量之和+ 18. 01056(单同位素质量) /18. 0152 (平均质量)。

(2) 计算突变前蛋白质的包含突变点的酶切肽段的分子量，与实测酶切肽段的分子量比较。如未找到对应的肽段，则应重新测试质量肽谱;如仍不能找到，则应考虑选用其他酶进行酶切实验。理论酶切肽谱可访问国际互联网:http://www.expasy.ch/tools/peptide-mass.html。

(3) 比较实测突变前后包含突变点在内的蛋白质的酶切肽段的分子量，两者误差在仪器固定误差之内(一般为0.1u)，则证明突变正确。

您可能对以下内容感兴趣：
蛋白表达与纯化    蛋白纯化服务