昆虫细胞培养是杆状病毒表达的关键步骤，本文总结了昆虫细胞培养最常见的问题，包括Sf9/Sf21/H5细胞。细胞形态变化或生长率改变表明潜在细胞问题。在平时的实验中养成记录细胞活率和倍增时间的习惯将有助于我们解决出现的问题。

问题	可能原因	解决方法
贴壁细胞：形态变化-第一周培养
细胞呈粒状或复苏后漂浮	没有在细胞复苏后1h移除旧培养基。DMSO在培养基中对细胞有害。	移除旧液，加入新液。
	H5细胞未能在培养基中复苏。	细胞适应几天。保持观察细胞。如果可以则可换成其他培养基。
	细胞表现出血清敏感性。	试用新型或批号血清，重新复苏细胞。
细胞裂解或形成碎片，活率和生长率降低	细胞传代超过30代。	复苏代次较低的新细胞。
	野毒或重组杆状病毒污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。
	能观察到细胞的裂解碎片和/或鼓胀。核心内容物指示野生型感染。	①复苏新细胞； ②净化层流罩和相关设备； ③配制新培养基。
	传代中机械力过大。	复苏新细胞 换一种传代的方法（如:脱落）
悬浮物（＞10%培养基中的细胞）	在形成融合单层之前传代太频繁。	①移除培养基/悬浮物； ②换新鲜培养基； ③在形成融合单层后再传代。
	细胞过度生长。	①如果是第一次发生需更换培养基和均分细胞； ②如果经常发生则需重新复苏细胞。
	对新批次或品牌血清敏感。	使用其他血清。
贴壁细胞：形态变化-培养一周后
细胞鼓胀，核内有斑点	野毒或重组杆状病毒污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。 ①复苏新细胞； ②配制新培养基； ③净化相关设备。
贴壁细胞：生长和/或活率降低
细胞倍增时间＞24h	传代方法太严格。	重新复苏细胞然后用其他传代方法（如：脱落）。
	细胞生长过度一次。	重新复苏细胞然后每天观察细胞避免过度生长。
	细胞处于高代次（高于30代）。	重新复苏细胞确保复苏细胞是低代次（少于10代）。
	细胞在融合前频繁传代。	①细胞形成融合后再传代； ②如果倍增时间没有增长，则复苏新细胞。
	细胞反复在低于20%融合时频繁传代。	浓缩细胞使融合达到50%或更高然后传代。
细胞活率低于90%	传代方法太严格。	重新复苏细胞然后用其他传代方法（如：脱落）。
	细胞融合前贴壁较紧频繁传代需较大的机械力。	①细胞形成融合后再传代； ②如果活率没有增长，重新复苏细胞。
	杆状病毒或真菌污染。	换掉旧培养基然后换新鲜培养基； ①净化相关设备； ②准备新鲜培养基。
	野毒或重组杆状病毒污染。可见细胞裂解、碎片和/或细胞鼓胀。核内容物表明野生型感染。	①净化相关设备； ②准备新鲜培养基； ③保持培养细胞培养基和培养病毒的培养基分开放置； ④在层流罩下不能同时进行细胞培养和病毒培养工作。
悬浮培养：生长和/或活率降低
倍增时间＞24h	悬浮移植或分得细胞密度过低（少于5×105细胞/mL）。	浓缩细胞至1×106细胞/mL。这样会促使细胞达到对数生长状态。
	悬浮培养过度密度＞3×106细胞/mL。	①分植细胞密度达到1.5×106细胞/mL； ②过夜生长密度达到2.5×106-3.0×106细胞/mL； ③分植使浓度达1.0×106细胞/mL，继续正常培养。
	通风不良。	①培养液体积不宜超过摇瓶容积的1/2； ②培养基体积接近最小要求体积； ③叶轮旋转流畅。急动颠簸则通风不良。
细胞活率低于90%	叶轮旋转剪切力。
	杆状病毒或真菌污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。 培养基加抗生素。
	野毒或重组杆状病毒污染。	换掉旧培养基然后使用新鲜培养基。
	可见细胞裂解、碎片和/或细胞鼓胀。核内容物表明野生型感染。	在能触及杆状病毒的地方要求使用完全无菌的摇瓶。
H5 悬浮培养中的问题
细胞聚团	细胞生长密度高于 2×106-2.5×106细胞/mL。	① 将 摇 瓶 在 层 流 罩 下 静30-45min 使聚团沉淀； ②移出含有小簇细胞和单个细胞的上 1/3 培养基置于新摇瓶继续培养
	旋转速率过低。	用 80-90rpm。
	适应未成功。	重试，初次尝试较常见。 如果没有加肝素，则加肝素
细胞裂解或形成碎片	陈旧细胞悬浮培养超过 2月。	重新复苏代次较低的细胞，然后开始新的悬浮培养。
	叶轮转动不畅。	调整摇瓶叶轮使其转动顺畅。

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