在真核系统蛋白表达与纯化中，x细胞培养是实验的根基。本文讲述了细胞培养中冻存与复苏的一些技巧与心得，虽然部分内容可能有些老生常谈，但是均来源于我们的实际经验，不管是刚上路的新手，还是多年的老手，希望对大家有一些帮助。

1.细胞冻存

  就冻存细胞而言，为了防止细胞在温度下降时产生胞内细微冰晶，其温度的下降不能太快。标准的操作是每一分钟下降一度。有以下三种建议：
（1）优先推荐使用程控降温仪。
（2）其次，加有异丙醇的细胞冻存盒，基本上也可以保证每分钟1℃左右的降温速度；
（3）最后，还有一些普遍的简易冻存方法。如4℃半小时，-20 ℃半小时，然后-80 ℃过夜，再放入液氮；用泡沫盒（装15mL离心管的那种）加一个保鲜袋，直接放在-80 ℃冻存；也可以用纱布做成袋子，将细胞悬挂在液氮上方，隔天转入液氮；在冻存管外面包上棉花，直接放在 -80℃冰箱就能够达到缓慢降温的效果；有的时候如果确实比较紧急的话，向96孔冻存盒的内部加满自来水，再将冻存管放置孔中，直接置于-80 ℃，这样也能够达到缓慢降温的目的。

  根据我们的经验，细胞复苏以后活性还是比较高的。当然，如果要长时期冻存的话，必须转移至液氮罐中。

  以前在另一家实验室的时候，冻存细胞根本就没有讲究这些标准操作。冻存的细胞有293T、PT67、C2C12、MEF (鼠胚胎成纤维细胞）、Hela S3、Hela D、U2OS、HKC、RK3E、ECO、H292、HSY、COS7、SupT1 等。将细胞酶消化后直接参与离心，加入冻存液（含90%的血清和10%的DMS0)，直接放在-80℃冰箱。两三天后移入液氮中，永久保存，几年后细胞的活力仍没有什么受损，照常能复苏，成活率高。 但有三点须注意： （1）第一是细胞的生长状态要好，不能长得过稀，同样也不能过密，细胞的状态看起来相当健康。70%密度的要保存的细胞须再长24 h才能全满，万一细胞状态不好，可以酶消化后再繁殖一次； （2）冻存细胞的量要留心，不能太密也不能太稀，一般1OOmm培养皿的细胞冻存为3~4管； （3）存放在-80℃冰箱的时间不能过长，一两天后转移到液氮罐里。我们也曾取出存放在-80℃冰箱的细胞，半年还有30% ~50%的细胞有活性，但一年的细胞就没有活的。

所以，冻存细胞要考虑的因素还是不少。当时实验室有一个高手，曾将长在100 mm培养皿的细胞酶消化后，用10 mL长生的培养基重悬，加入1.1 mL的DMSO,将细胞分成20管，一次性冻存于-80 ℃冰箱，半年后这位老兄还在用这些细胞，效果也不差。他懒得一次又一次地繁殖细胞，等到要用细胞时复苏一管，培养两三天后就可以用。这样看来，各人有各招，能行就可以。

2.细胞复苏

  不同的实验室有不同的方法，但基本原则是一样的，就是升温要快。从液氮中取出细胞后，马上置于37 ℃的水浴中，有时都能听到冻存管发出“啪啪”的声音，甚至会爆裂冻存管的盖子。但后来的操作要小心，不能一次性将细胞直接加在较大体积的新鲜培养基中，以免细胞的渗透压一时难以调节，降低细胞的存活率。特别是对于那些对渗透压比较敏感的细胞，如PT67之类的细胞。所以在复苏细胞时，操作上宜缓。我们的改进是：37℃的水浴等细胞刚刚融化，在冻存管里加入0.5倍体积的新鲜培养基，轻轻混匀，室温放置3 ~5 min,移取所有溶液到15 mL的离心管中，再加入3 ~5mL的培养基，离心后转入培养皿中，这样操作，细胞的状态比较好。

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