考马斯亮蓝染色法，也称Bradford检测法，是目前灵敏度最高的蛋白质测定方法。其最早是在1976年由Bradford根据蛋白质与染料相结合的原理建立。

1.Bradford法原理

在酸性分析试剂溶液中，染料考马斯亮蓝 G-250与蛋白质结合的主要是阴离子形式的蓝色，其最大吸收峰 （λ_max）位置在590nm，形成的复合物颜色的深浅与蛋白浓度的高低成正比关系。因此，通过测定染料的蓝色离子态可以定量测定蛋白质，通常测定595nm下的吸光度

研究认为染料最容易与蛋白质中的精氨酰和赖氨酰残基结合，由于各种蛋白质中的含量不同，与染料的相互作用有强有弱，导致测定不同蛋白质时偏差较大。进行了一些改良后，可以克服波动问题，但通常会导致检测更容易受其他化合物的干扰。

2.Bradford法优缺点分析

优点	缺点
①.方便简单快速； ②.灵敏度高。 ③.受生物制品中的非蛋白质组分和常用试剂的干扰更少。	①.易受强碱性缓冲液、TritonX-100、SDS等去污剂的影响。 ②.标准曲线有轻微的非线性。 ③.不同蛋白质测定时有较大的偏差。

3.Bradford法实验流程

(1)染料试剂 100mg考 马 斯 亮 蓝 G-250溶 解 在50ml 95%乙 醇，然 后 与100ml 85%磷酸混合，加入蒸馏水配成1L。棕色瓶中室温下可储存数周，使用前必须用滤纸过滤除去储存试剂中沉淀的染料。在常规蛋白测定中，对染料的品质无严格要求，考马斯亮蓝 G-250中可溶性染料的含量因来源和供应商不同变动很大，通常认为Serva蓝G 含量最高，往往用于改良测定法中。

(2)蛋白质标准在考马斯亮蓝法中，由于最常用的蛋白质标准牛血清蛋白与染料的反应偏大，导致测定的样品蛋白含量偏低。因此，选择标准蛋白质建立标准曲线时，尽量采用与待测样品蛋白相同的蛋白质，或者选用与染料结合能力接近于蛋白质平均值的牛γ球蛋白为蛋白质标准，以减小偏差。在 具 体 报 告 测定量时，必须说明所用的蛋白质标准。蒸馏水 配 置 牛 γ球 蛋 白 储 液，-20℃存 放。使用前用 280nm 下的吸光度测定标准溶液中精确的蛋白浓度，γ球 蛋 白A₂₈₀^1mg/ml（1cm光程）为1.35.

(3)检测器皿要求使用洁净无洗涤剂的塑料器皿或玻璃器皿，用甲醇或去污剂漂洗去除器皿上的染料痕迹。请勿使用石英、硅胶比色杯，因为染料会结合在此类材料上。

(4)检测方法有标准检测和微量检测两种分析类型，分 别 适 用 于 10-100μg蛋白质和1-10μg蛋白质的测定。由于检测试剂因存储时间会导致吸光度的变化，所以每次检测必须作标准曲线。

①样品稀释 吸取100μL蛋白样品稀释液 （10⁰，10^-1，10^-2，10^-3）双份。
②制备标准曲线吸取γ球蛋白储液 （标准检测中储液浓度1mg/ml，微量检测中储液浓度100μg/ml），分别取10μl、20μl、40μl、60μl、80μl、100μl各双份，用蒸馏水配成100μl，以蒸馏水为试剂空白。
③测定加入染料试剂 （加入量：标准检测5ml，微量检测1ml），混合均匀 （倒置翻转或轻轻振荡，避免气泡）。染料与蛋白质结合的过程只需要2min，复合物的颜色在1h内保持稳定 （5-20min内稳定性最好）。因此加入染料试剂2-60min内，测定各管的吸光度，不需要严格控制时间。
④计算标准曲线轻微非线性，在标准检 测 中，100μg γ-球 蛋 白 的 A₅₉₅约 为0.4；在微量检测中，10μg γ-球蛋白的A₅₉₅为0.45。根据待测样品的吸光度，从标准曲线上计算出样品蛋白质浓度。

4.注意事项

(1)相对来说，考马斯亮蓝法不受绝大多数常用生物化学试剂的干扰。不过有一些 化 合 物 会 明 显 改 变 空 白 的 吸 光 度 或 是 减 缓 蛋 白 质 与 染 料 的 反 应.(见下表)

化合物	OD595的变化	相当于的BSA/μg	化合物	OD595的变化	相当于的BSA/μg
1mol/L KCl	0.000	0.00	1mol/L 巯基乙醇	0.004	0.36
5mol/L NaCl	0.000	0.00	0.1mol/L EDTA	0.004	0.36
1mol/L MgCl2	0.000	0.00	1mol/L 蔗糖	0.013	1.17
1mol/L 硫酸铵	0.000	0.00	5% 苯酚	0.046	4.14
95% 乙醇	0.000	0.00	丙酮	0.069	6.21
0.1% SDS	0.011	0.99	0.1% Triton X-100	0.013	1.17
1% SDS	0.495	44.55	1% Triton X-100	0.590	53.10
2mol/L Tris	0.026	2.34	99%甘油	0.012	1.08

在碱性条件下，由于游离染料的解离平衡向阴离子形式移动，从而使碱性缓冲液中的蛋白质吸光度增大。此外，盐酸胍、抗坏血酸 （维生素 C）能和染料竞争与蛋白质的反应，导致测得的蛋白质含量降低。

通常认为测 定 中 的 主 要 干 扰 物 为 去 污 剂、Triton X-100、十 二 烷 基 硫 酸 钠（SDS）以及0.1mol/L的 NaOH。因 此，测定前用凝胶过滤或透析去除样品溶 液中的洗涤剂和两性电解质。

在测定含有膜成分的蛋白质时，往 往 采 用 膜 裂 解 剂 （NaOH或 洗 涤 剂）预处理样品，此时对测定结果的处理要谨慎。

(2)在改良检测法中，提高染料的浓度或溶液pH，增大游离染料中能与蛋白质反应的蓝色离子态的比例，可提高检测的灵敏度，大大降低不同蛋白质引起的波动，但是样品对表面活性剂的干扰更敏感。

(3)考马斯亮蓝法测定的蛋白质溶液浓度不能太高，因为蛋白质浓度高时，游离染料的含量大为减少，会导致标准曲线的非线性。根据染料试剂在未与蛋白质结合之前本身为棕褐色，在465nm 下有吸收，可采用595nm 和465nm 下吸光度的比值作图，来修正游离染料的耗尽，提高标准曲线的线性和测定的精确度。

(4)由于蛋白质与染料结合后形成的复合物有更高的消光系数，因此随着蛋白质浓度 的 变 化，光 吸 收 值 变 化 也 大，灵 敏 度 很 高，蛋 白 质 的 最 低 检 测 量 达2.5～1μg。

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