蛋白质样品的提取和分离是进行蛋白表达后与蛋白纯化前的第一步，在蛋白质纯化中 首先要获得蛋白质的提取液，恰当地选择蛋白质提取及分离的方法将有助于随后的纯化过程。

 

     对于固态样品材料，一般先进行目的蛋白的提取，然后分离纯化。 对于微生物发酵或动植物细胞培养得到的悬浮液，具体的操作方法视蛋白质在细 胞内外的位置而不同。

    （1）对于细胞内蛋白质，必须先破碎细胞。在发酵罐中生长的细胞要先浓缩，从而提高细胞破碎的效率。在细胞破碎过程中加入蛋白酶的抑制剂，可避免因细胞破碎而释放出的蛋白酶的作用，应尽量缩短操作时间并且在较低温度下（比如４℃）操作。细菌细胞和细胞碎片难于离心或过滤除去，因为它们太小、可压缩。采用絮凝方法有助于除去这些颗粒。

    （2）对于细胞外蛋白质，目的蛋白存在于悬浮液中，可直接采用离心、过滤等操作来进行固液分离，除去细胞和其他颗粒物质，以排除它们对随后的纯化过程的干扰。提取液若准备进入色谱柱，则必须先除去所有颗粒物质，以免污染和堵塞色谱柱。如果提取液随后要进行沉淀，对少量颗粒物质可以忽略不处理，它们会在沉淀过程中聚沉而被除去。

    对蛋白质样品的提取应尽量多地提取出目的蛋白，并且保持其活性少受损失。蛋白质的提取常用各种水溶液，一般在偏离蛋白质等电点0.5ｐＨ单位以上，此时蛋白质的溶解度增加。

    （1）提取等电点在碱性范围的蛋白质，可以用稀酸；
    （2）对等电点在酸性范围的蛋白质，可以用稀碱提取，以尽可能提高目的蛋白在提取 液中的溶解度。

    但是也要注意提取液的ｐＨ应该在目的蛋白稳定的范围内，避免极端ｐＨ。提取液的离子强度一般不能太高，以免引起盐析。提取液与提取物的比例通常为５∶１，比例如果过大，会影响到随后纯化过程所用时间及纯化效率。

     细胞破碎后进行目的蛋白的提取。大部分目的蛋白保留在液相中，为了减少 损失，常用大量的缓冲液。

    （1）对于动物组织，破碎用缓冲液体积为动物组织的２-2.5倍；
    （2）对于植物细胞，可以用较少数量的缓冲液来提取。选择破碎细胞用的缓冲液受到目的蛋白的稳定性和可溶性的影响，并且受到随后的纯化过程的影响，可以用水，但是会造成离子强度和ｐＨ降低。在低离子强度和ｐＨ下，很多蛋白质不可溶，或者失去活性。

细胞的破碎

    很多情况下，微生物分泌蛋白质到培养基中，提取分离蛋白质就比较容易， 而对于细胞内蛋白质（比如酵母产生的葡萄糖-６-磷酸脱氢酶，黑曲霉产生的过氧化氢酶及葡萄糖氧化酶等），则需要采用机械方法或非机械方法对细胞进行有效的破碎。在实验室内已经有不少破碎细胞的方法，常用的机械方法包括超声波法、高压匀浆法、高速珠磨法等，非机械方法有干燥法、冻融法、渗透压冲击法、酶解法、溶剂法。

    细胞破碎是获得微生物细胞内产物的中间一步，因此在设计方案时需要综合考虑上游和下游过程的影响，上游过程中细胞组织所处的生理活性状态将影响到细胞的破碎，下游过程中须考虑到破碎细胞时所产生的细胞碎片，防止其他蛋白质对产物的污染及产物的失活。

选择细胞的破碎方法要考虑破碎的目的和破碎对象的类型。如果为了定量获得细胞内蛋白质以进一步研究，破碎收率就很重要。细胞的类型、大小、形态、生长条件、细胞壁结构及环境温度、ｐＨ等因素都会造成细胞对不同破碎方法的敏感度也不同。可以根据实验及以往的经验来选择破碎方法，但要注意破碎不能影响到目的蛋白产物的活性，在细胞的破碎过程中尽量避免将产物暴露在不利的条件下。破碎过程中，常常产生比较多的热量，需要 预先冷却样品（最好到４℃），在破碎过程中，应尽可能保持低温。另外，一旦细胞被破碎，就失去了代谢调节机制的控制，目的蛋白就会受蛋白酶的作用，因此需要迅速提取目的蛋白，或加入抑制剂，或降温以减小蛋白酶的作用。以下是几种主要的细胞破碎方法的比较。

方法	原理	优点	缺点
超声波法	强烈的超声波造成细胞悬浮液中气泡的增大和爆裂	效果好、所需样品数量少，实验室应用广泛	不适宜大规模细胞破碎，需要控制温度
高速珠磨法	高速珠磨破碎细胞	快速有效	破碎最优条件难摸索
高压匀浆法	细胞受到剪切、碰撞、压力骤变等作用而被破碎，释放出目的蛋白	适用广，可用于大规模破碎细胞	对于细胞膜结合的蛋白，需要多次破碎
冻融法	将待破碎的细胞置于低温下（-１５℃）冷冻，再在室温下融化	适合于细胞壁较脆弱易破的微生物菌体	破碎率低，蛋白易失活
酶解法	只需要选择合适的酶及反应条件， 就可以有效地进行细胞的破碎	专一性强，操作条件温和，收率高	成本高，无法工业化

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