原核蛋白表达案例-乳酸菌蛋白表达(Nisin诱导的NICE体系)

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乳酸菌蛋白表达服务实验报告案例

一、实验设计

以客户提供的序列合成目的基因,并在目的基因C端融合6*His标签,将合成好的基因构建在PNZ8148载体上,通过测序和酶切验证,获得亚克隆正确的表达质粒。
将构建好的表达质粒电转入NZ9000菌株,通过含氯霉素的选择性培养基筛选阳性菌株,通过PCR及测序验证阳性菌株。
利用Nisin于30℃诱导阳性菌株表达,通过SDS-PAGE和Western Blot确认蛋白分布在上清或是沉淀中。

二、试剂和耗材

名称 公司 名称 公司
PNZ8148质粒 钟鼎实验保存 MC1061 菌株 钟鼎生物保种
NZ9000 钟鼎实验保存 DNA Marker 钟鼎生物自制
0.22 μm无菌滤器和透析袋 Millipore公司 Agarose 上海基因公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒 AXYGEN公司 常规生化试剂为国产分析纯

三、培养基配方如下:

GM培养基:M17 broth with: 0.5% lactose or glucose
GSGM:GSGM17培养基0.5M蔗糖+25 g/L甘氨酸+M17培养基+5 g/L葡萄糖
溶液I 0.5 mol/L蔗糖+100 ml/L甘油
溶液Ⅱ 0.5 mol/L蔗糖+100 ml/L甘油+0.05 mol/L EDTA
GMMC恢复培养基:M17培养基+0.5%葡萄糖+20mM MgC12+2 mM CaC12

四、主要实验仪器

仪器名称 公司 仪器名称 公司 仪器名称 公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 美国BECKMAN公司 台式高速离心机 德国SORVAL公司 Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统 美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪 美国MJ Research公司 320-S pH计 美国Mettler Toledo公司 AR5120电子天平 美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪 美国Amersham Pharmacia公司 雪花状制冰机 日本SANYO公司 JY92-2D超声波细胞粉碎机 中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪 南京大学普阳科学仪器厂 Gene Pulser Xcell 电穿孔系统 美国BIO-RAD 超净工作台 中国苏净集团

五、实验方法及结果

1、pNZ8148-xx质粒构建

  

将获得的线性化目的基因与目标载体连接,连接产物转化MC1061克隆菌株,挑取阳性克隆子测序,测序结果如下所示。
A A G G A A C T A C A A A A T A A A T T A T A A G G A G G C A C T C A C C A T G G G T A A A A A A A A G A T T A T C T C A G C T A T T T T A A T G T C T A C A G T G A T A C T T T C T G C T G C A G C N N N N N N N N N N N N N N--------------涉及客户研究内容,不予显示--------------- N N N N N N N N N N N N N N N N N C T T T C T T T G A A C C A A A A T T A G A A A A C C A A G G C T T G A A A C G T T C A A T T G A A A T G G C A A T T A A

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示:

乳酸菌蛋白表达

pNZ8148酶切验证与载体图谱如下:

乳酸菌蛋白表达

翻译后蛋白序列如下,分子量为XXX KD,PI 5.43:
M G K K K I N N N N N N N N N N N -----涉及客户研究内容,省略----- N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N D I R E

2、电转乳酸菌NZ9000

2.1、NZ9000乳酸菌感受态的制备

(1). 新鲜培养板上挑取单菌落接种于5 ml GM培养液中,30℃培养过夜;
(2). 将5 ml NZ9000转种于50 ml GSGM17 培养液中,30℃过夜培养;
(3). 将5 ml NZ9000转种于400 ml GSGM17培养液中,30℃培养至OD600为0.2-0.3时,4℃、4000 rpm/min离心20 min,收集菌体;
(4). 用400 ml溶液Ⅰ洗涤1次;加100 ml溶液Ⅱ,充分混匀后于冰上静置15 min,4 ℃ 4 000 rpm/min离心20min,收集菌体;
(5). 继续用100 ml溶液Ⅰ洗涤1次,最后用4 ml溶液Ⅰ悬浮细菌,并分装成每管40ul ,于-80℃贮存。

2.2、乳酸菌转化及PCR鉴定阳性克隆菌株

(1). 将1μl质粒与40μl感受态细胞均匀混合,转入冰浴的0.2 cm电转化杯中;
(2). 设置电击参数,2000V,25μF,200Ω, 然后将转化杯置于电击槽中电击;
(3). 电击后立即加入1ml GMMC恢复培养基,冰浴5 min后转入1.5 ml Enpendorf管中,置于30℃恢复培养1-1.5h;
(4). 取恢复菌液铺于含相应抗生素的GM 培养板上,分别涂10μl,100μl,900μl于平板上,待菌液吸收完全后,于30 ℃、静止培养40h,待转化子出现。

表达质粒电转乳酸菌后转化平板图

乳酸菌蛋白表达

PCR鉴定阳性菌株

乳酸菌蛋白表达

3、Nisin诱导蛋白表达鉴定

乳酸菌蛋白表达