经典的ＦＤＮＢ法是Ｎ 末 端氨基酸的分析方法，是蛋白质化学中最重要的方法之一，可用于测定蛋白质或 肽的Ｎ末端基团、蛋白质中肽链的数目、蛋白质的最小分子量及蛋白质水解产 物的氨基酸组成。

ＦＤＮＢ法的反应原理如图１所示。２，４-二硝基氟苯（ＦＤＮＢ）在很温和的 条件下（室温，ｐＨ＝８～９），能与蛋白质的游离氨基反应，生成二硝基氟苯衍生 物———ＤＮＰ蛋白。ＤＮＰ蛋白完全水解释放出Ｎ末端的ＤＮＰ-氨基酸，通过色谱 分离后与标准ＤＮＰ氨基酸对照进行鉴定。

图1 ＦＤＮＢ法的反应原理

ＦＤＮＢ的反应性很强，能在不引起肽链断裂的温和条件下，定量与蛋白质反 应，因而在测定过程中不会因肽链断裂而人为形成“新”末端。除了某些链内氨 基酸衍生物外，ＤＮＰ-氨基酸都呈黄色，非常有利于检测。

虽然ＦＤＮＢ也能与α-氨基外的其他少数基团反应，但生成物并不影响Ｎ端 氨基酸的分析，如ｏ-ＤＮＰ酪氨酸（无色）、ｉｍ-ＤＮＰ组氨酸（无色）、ε-ＤＮＰ赖 氨酸（黄色，醚不溶），因而ＦＤＮＢ是一个理想的端基分析试剂。

ＤＮＢ法的具体分析过程如下：

① 蛋白质的二硝基苯化　反应在微碱性介质中进行，在ＮａＨＣＯ_３ 存在下，暗室中反应，反应时间主要取决于蛋白质样品的溶解度和反应性。

② 除去过量试剂　反应结束后酸化处理，离心，并用醇、醚洗涤，ＤＮＰ蛋 白质避光储存。

③ ＤＮＰ-蛋白质的水解　用盐酸水解时，大部分ＤＮＰ-氨基酸不会被破坏 （表１）。

④ 分离ＤＮＰ-氨基酸　根据各自的溶解度以有机溶剂乙醚从水解产物中 提取。

表１　酸水解时的ＤＮＰ-氨基酸的回收率
ＤＮＰ-氨基	５.７ｍｏｌ／Ｌ盐酸水解		１２ｍｏｌ／Ｌ盐酸１０５℃水解１６ｈ 回收率／％
	水解时间／ｈ	回收率／％
DNP-Ala DNP-Arg DNP-Asp 双-DNP-Cys DNP-Glu DNP-Gly DNP-Ile DNP-Leu 双-DNP-Lys ε-DNP-Lys DNP-Met DNP- Phe DNP-Pro DNP- Ser DNP-The DNP- Trp 双-DNP-Tyr DNP-Val	12 24 12 12 8 12 12 8 12 12 12 12 24 12 12 12	80 90 60 25 75 40 80 80 95 95 70 10 90 90 90 75 80	75 75 75 75 50 75 75 75 75 75 50 50 75 75 50 75

⑤ ＤＮＰ-氨基酸的分析　采用单相或双相纸色谱、硅胶薄板色谱，与标准 ＤＮＰ氨基酸对照进行定量分析。

用ＦＤＮＢ法鉴定出α-Ｎ-ＤＮＰ-氨基酸，并确定Ｎ末端氨基酸的数目，从而计 算出多肽链的数目。但在有些情况下，会检测不到末端基团：末端封闭，无游离 α-氨基的环状化合物；末端乙酰化；ＤＮＰ-氨基酸被分解，如ＤＮＰ-Ｐｒｏ、ＤＮＰ- Ｇｌｙ；酸解未形成ＤＮＰ-氨基酸，如末端为Ｖａｌ、Ｉｌｅ时，水解生成ＤＮＰ-小肽。

在ＦＤＮＢ法中，由于ＤＮＰ-氨基酸对光敏感，实验必须避光在暗处进行。此 外，酸水解ＤＮＰ-蛋白质获得氨基酸和ＤＮＰ-氨基酸的混合物，必须反复抽提来 分离。因此，作为端基分析的经典方法，ＦＤＮＢ法近年来逐步被操作更简单、灵 敏度更高的ＤＮＳ法代替。

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