大肠杆菌（E.coli）中RNA聚合酶的提取和纯化

　　对于RNA聚合酶以及其他众多的DNA结合蛋白，常使用亲和色谱技术来分离。利用此类蛋白质与DNA的特异性结合能力，可以将小段含有特定序列的DNA作为配基连接到支持基质上构成亲和色谱的介质。但是这样的配基在细胞外是很容易受到核酸酶的攻击而发生降解的，因此人们多数情况下并不选用核酸本身作为配基，而是选择-些具有类似生物学特性的其他亲和配基，例如肝素，由于该分子既有亲和力，又带电荷，能与蛋白质发生离子作用，因此是用亲和色谱法分离DNA结合蛋白的理想配基。这里介绍采用亲和、凝胶过滤和离子交换三步色谱的方法从大肠杆菌培养液中分离RNA聚合酶。

　　将E.coli 培养液离心后收获细胞，向其中加人两倍体积的裂解缓冲液[20mmol/L Tris-HCl, pH=8，含5% (体积分数)甘油、1mmol/L EDTA、0.25mol/L NaCl、20mmol/L 2-巯基乙醇、lmmol/L Pefabloc]使之悬浮，在冰浴中进行超声破碎，然后于5℃、12100g 离心1h，弃去沉淀得到上清液作为原料。向上清液中添加硫酸铵至终浓度为50%饱和度，于冰浴中搅拌30min使RNA聚合酶充分沉淀，于5℃、12100g离心90min，弃上清，将沉淀溶解于起始缓冲液[20mmol/L Tris-HCl, pH=8，含5%(体积分数)甘油、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L 2-巯基乙醇、0.1mmol/L Pefabloc、0.2mol/L NaCl]，并利用PD-10凝胶柱进行缓冲液交换。样品用0.45um滤膜过滤后进行亲和色谱，色谱柱为HiTrapHeparin 5ml,取35ml样品上样，并用起始缓冲液洗涤色谱柱，流速为1ml/min(30cm/h)，洗去穿透峰后进行洗脱，极限缓冲液为20mmol/LTris-HCl，pH=8，含5%(体积分数)甘油、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L2-巯基乙醇、0.1mmol/L Pefabloc、1.0mol/L NaCl。采用NaCl 浓度线图 11.13 HiTrap Heparin 5ml亲和色谱图性梯度洗脱，斜率为20个柱体积内NaCl浓度从0.2mol/L增至1.0mol/L。分部收集，结果见图1。

　　上步收集得到的活性分部经浓缩后进行凝胶过滤色谱，采用的色谱柱是Superdex 200 HR10/30。取0.5ml样品上样，洗脱缓冲液为20mmol/L Tris-HCl, pH=8，含5%(体积分数)甘油、0.1mmol/L EDTA、10mmol/L 2-巯基乙醇、0.1mmol/L Pefabloc、0.2mol/L NaCl， 流速为0.25ml/min (19cm/h),得到结果如图2所示。

　　 凝胶过滤分离的同时也实现了缓冲液交换，将上步收集得到的样品直接进行离子交换色谱。色谱柱选用HiTrap Q 1ml,加样量为1ml,加样后用起始缓冲液洗涤，流速为1ml/min (158cm/h)。 起始缓冲液和极限缓冲液的成分均与亲和色谱时相同。采用NaCl浓度线性梯度洗脱，斜率为30个柱体积内NaCl浓度从0.2mol/L增至0.5mol/L，分部收集，每分部为0. 5ml,所得结果如图3所示。纯化后的样品经SDS-PAGE分析纯度为90%。

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