1、表达条件
| 表达条件 | |||
|---|---|---|---|
| 培养温度 | 37℃ | 培养时间 * | 4hr |
| 诱导温度 | 20℃ | 诱导时间 | 12-16hr |
| IPTG 浓度 | 0.4mM | 培养基名称 | LB |
| 蛋白表达形式 | 破碎上清 | ||
| 纯化样品来源 | 破碎上清 | ||
当培养至4小时左右的时候，OD600的数值在0.6-0.8之间。
2、GST上清表达纯化过程
2.1 试剂和耗材
| 试剂和耗材 | |
|---|---|
| pGEX-4T-1 质粒（Zoonbio保存） | TOP10克隆 菌株（Zoonbio保种） |
| Arctic-ExpressTM表达菌（Zoonbio保种） | Protein Marker（购自Thermo公司） |
| IPTG、Acr、Bis、Tris（购自Sigma公司） | SDS（购自Amresco公司） |
| TEMED（购自BIO-RAD公司） | Tryptone、Yeast Extract（购自 OXOID公司） |
| 0.22 μm无菌滤器和透析袋（购自Millipore公司） | GST亲和层析胶（购自GE公司） |
| 其它试剂均为国产分析纯 | |
2.2实验仪器
| 实验仪器 | |
|---|---|
| Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司） | 台式高速离心机（德国SORVAL公司） |
| Mini Protean II垂直平板电泳系统、GeL Doc2000 成像系统（美国BIO-RAD公司） | PTC-200基因扩增仪（美国MJ Research公司） |
| 320-S pH计（美国MettLer ToLedo公司） | 雪花状制冰机（日本SANYO公司） |
| JY92-2D超声波细胞粉碎机（中国新芝科器研究所） | 超净工作台（中国苏净集团） |
2.3 实验方法及结果
2.3.1 重组载体转化至大肠杆菌Arctic Express（以Arctic Express为例，其余菌转化和表达步骤同下）
(1)将质粒1 μL加入100 μL感受态细菌中，置冰上20 min。
(2)42℃热激90 sec，迅速置冰中5 min，加入600 μL LB培养液。
(3)37℃，220 r/min振摇1 h，离心后全部涂布于含50 μg/mL Amp的LB平板，37℃倒置培养过夜。
2.3.2 IPTG诱导重组载体载体融合蛋白表达
(1)挑取转化平板上的单克隆接种于含50 μg/mL Amp的3 mL LB培养液的试管中，37℃ 220 r/min振摇过夜。
(2)次日按1:100接种于50 μg/mL Amp的30 mL LB培养液中，37℃ 220 r/min振摇至菌体OD600为0.6-0.8。
(3)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。
(4)向剩余的培养物中加入IPTG至终浓度为0.4 mM，20℃ 220 r/min振摇过夜，诱导融合蛋白表达。
(5)取出1 mL培养物，10000 r/min室温离心2 min，弃上清，用100 μL 1×上样缓冲液重悬菌体沉淀。剩余培养物4000 r/min，离心10 min，弃上清，用 PBS重悬菌体沉淀；重悬液进行超声波破碎后，分别取上清液与沉淀加入上样缓冲液重悬。
(6)进行12% SDS-PAGE检测分析，考马斯亮蓝染色显带。
(7)根据鉴定结果，将培养的体积扩大至1L，收集菌泥后，破碎，选择破碎上清进行后续纯化。
2.3.3融合蛋白的GST柱亲和纯化及结果分析
(1)利用低压层析系统，上清溶液以0.5 mL/min流速上样至GST Binding-Buffer预平衡的GST亲和层析柱。
(2)用GST Binding-Buffer以0.5 mL/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线。
(3)用GST Elution-Buffer（20 mM Tris-HCl，50 mM GSH， 0.15 M NaCl，pH 8.0）以1 mL/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液。
(4)上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS析过夜。
(5)进行12% SDS-PAGE分析。
3、SDS-PAGE过程
3.1仪器和耗材
| 仪器和耗材 | |
|---|---|
| Protein Marker（购自Thermo公司） | IPTG、Acr、Bis、Tris（购自Sigma公司） |
| SDS（购自Amresco公司） | TEMED（购自BIO-RAD公司） |
| 0.22 μm无菌滤器和透析袋（购自Millipore公司） | 其它试剂均为国产分析纯 |
3.2主要实验仪器
| 实验仪器 | |
|---|---|
| Allegra 21R台式高速冷冻离心机（美国BECKMAN公司） | 台式高速离心机（德国SORVAL公司） |
| Mini Protean II垂直平板电泳系统（美国BIO-RAD公司） | 320-S pH计（美国MettLer ToLedo公司） |
| 雪花状制冰机（日本SANYO公司） | |
3.3试剂配制
(1)30%丙烯酰胺(29:1)： 称取Acrylamide 29 g、Bisacrylamide 1 g，加入约60 ml的去离子水，充分搅拌溶解。加去离子水将溶液定容至100 mL，用0.45um滤膜滤杂质，于4℃避光保存。
(2)1.5mol/L Tris-HCl(pH8.8) ： 称取Tris-base 45.43 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至8.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。
(3)0.5mol/L Tris-HCl(pH6.8) ：称取Tris-base 15.14 g，加入约200 mL去离子水，搅拌溶解；用浓盐酸调pH至6.8，最后用去离子水定容至250 mL，室温下保存。
(4)10 %过硫酸胺(AP) ：称取过硫酸胺0.1 g 溶于1.0 mL 灭菌的去离子水中，充分混匀后于4 ℃避光保存，保存时间不能超过1周。
(5)5×Tris-Glycine电泳缓冲液：称取Tris-base 15.1 g、Glycine 94 g、SDS 5 g置于1 L烧杯中，加入约800 mL的去离子水，搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
(6)考马斯亮蓝染色液：称取1 g考马斯亮蓝R-250，置于1 L烧杯中；量取250 mL异丙醇加入上述烧杯中，搅拌溶解；加入100 mL的冰醋酸，搅拌均匀；加入650 mL去离子水，搅拌均匀；用滤纸除去颗粒物质后，室温保存备用。
(7)脱色液：取冰醋酸 100 mL、乙醇50 mL，加去离子水定溶至1L，搅拌均匀，室温保存备用。
3.4实验过程
3.4.1根据目的蛋白的大小，选择合适的分离胶
| SDS-PAGE分离胶浓度 | 最佳分离范围 |
|---|---|
| 6%胶 | 50-150kD |
| 6%胶 | 30-90kD |
| 10%胶 | 20-80kD |
| 12%胶 | 12-60kD |
| 15%胶 | 10-40kD |
3.4.2凝胶配制
3.4.2.1组装胶架
将洁净、无水的玻片对齐，形成空腔，插入塑料框的凹槽中，注意箭头向上，并确保下端平齐。放于制胶架上夹紧，下端紧贴密封条。
| 12%分离胶配方如下表： | |||||
|---|---|---|---|---|---|
| 成分 | SDS-PAGE分离 | ||||
| 12%胶体积 | 5 | 10 | 15 | 20 | 30 |
| 蒸馏水 | 1.0 | 2.0 | 3.0 | 4.0 | 6.0 |
| 30%Acr-Bis(29:1) | 2.0 | 4.0 | 6.0 | 8.0 | 12.0 |
| 1.5M Tris,pH8.8 | 1.9 | 3.8 | 5.7 | 7.6 | 11.4 |
| 10%SDS | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.3 |
| 10%过硫酸铵 | 0.05 | 0.1 | 0.15 | 0.2 | 0.3 |
| TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.012 |
3.4.2.2灌胶
混匀后用移液枪将凝胶溶液沿玻棒小心注入到长、短玻璃板间的狭缝内(胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm)。
3.4.2.3液封
在凝胶表面沿短玻板边缘轻轻加一层无水乙醇以隔绝空气，使胶面平整。静置约30min观察胶面变化，当看到水与凝固的胶面有折射率不同的界限时，表明胶已完全凝固，倒掉上层水，并用滤纸吸干残留的水液。
关键点：无水乙醇封胶之后，将无水乙醇掉到后液面必须水平平整。
3.4.2.4浓缩胶的配制
| 浓缩胶的配方如下 | ||||||
|---|---|---|---|---|---|---|
| 成分 | SDS-PAGE浓缩胶 | |||||
| 5%胶体积 | 2 | 3 | 4 | 6 | 8 | 10 |
| 蒸馏水 | 1.4 | 2.1 | 2.7 | 4.1 | 5.5 | 6.8 |
| 30%Acr-Bis(29:1) | 0.33 | 0.5 | 0.67 | 1.0 | 1.3 | 1.7 |
| 1M Tris,pH6.8 | 0.25 | 0.38 | 0.5 | 0.75 | 1.0 | 1.25 |
| 10%SDS | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
| 10%过硫酸铵 | 0.02 | 0.03 | 0.04 | 0.06 | 0.08 | 0.1 |
| TEMED | 0.002 | 0.004 | 0.006 | 0.008 | 0.01 | |
关键点：浓缩胶在配置过程中夏天温度较高，TEMED的要减少三分之一的量。
3.4.2.5插入制胶梳
混匀后用移液枪将凝胶溶液注入到长、短玻璃板间的狭缝内(分离胶上方)，轻轻加入样品模板梳，小心避免气泡的出现。约30分钟，聚合完全。
3.5电泳
3.5.1安装电泳槽
将制备好的凝胶板取下，小心拔下梳子。两块12%的凝胶板分别插到U形橡胶框的两边凹形槽中，可往上提起使凝胶板紧贴橡胶。将装好玻璃板的胶模框平放在仰放的贮槽框上，其下缘与贮槽框下缘对齐，放入电泳槽内。倒入1X Tris-Gly电泳缓冲液。
关键点：短玻璃板放置内侧。
3.5.2样品处理
样品直接取80µl的样品，依次加上20µl 5x buffer (加了B-巯基乙醇)，混匀。煮沸10分钟。12000rpm离心10min，备用。
3.5.3加样
用移液枪取处理过的样品溶液5μl，小心地依次加入到各凝胶凹形样品槽内，marker 加入到其中一个槽内，为区别两块板，marker可加在不同的孔槽中。
关键点：鉴定图片样品点样时一定要取上清，样品粘稠不能进行上样，需要进行稀释，否则图片会模糊条带不清晰。
3.5.4电泳
将电泳槽放置电泳仪上，接通电源，正负极对好（以盖子盖严为准，盖子有两个小洞，这与电泳槽是对应的）。电压调至约80v保持恒压。待溴酚蓝在浓缩胶和分离胶界面压成一条直线后，调整电压至120v，溴酚蓝标记移动到凝胶底部时，关电源，把电泳缓冲液倒回瓶中。
3.5.5剥离胶
把电泳槽取出，两块板拿下来，用刮片从长短玻片中间翘起，轻轻取下凝胶，放置于含有20ml染色液的器皿中。
3.5.6染色
将器皿至于微波炉中，中火加热10min，取出置于摇床上，轻摇约0.5小时，完成后染液回收并用水洗掉染液。
3.5.7脱色
取出染色过的胶放于加有脱色液的染缸里，脱色液漫过胶即可将器皿至于微波炉中，中火加热10min，置于摇床上，轻摇过夜，次日将胶放置于清水中，直至背景清楚为止。
关键点：脱色过程中不能将蛋白条带脱太淡。
3.5.8拍照
将脱色后的胶置于透明文件夹中，把胶上面的气泡赶出（用前也可用酒精棉球擦干净文件夹），放到扫描仪上，拍照。
4、Western Blot过程
4.1试剂及器材
4.1.1器材
| 器材名称 | 厂家 |
|---|---|
| 转移电泳仪 | 上海天能，VE-140 |
| 转移电泳槽 | 上海天能，VE-140 |
| 气浴振荡器 | 南大普阳 |
| 暗盒 | 自配 |
| 台式微量高速离心机 | H1650-W长沙湘仪离心机仪器有限公司 |
| 移液器 | 10µl/50µl/200µl/1000µl Eppendorf |
| X光片 | 柯达 |
4.1.2试剂
| 试剂名称 | 配方 |
|---|---|
| ECL显色液：A B | 普利莱 |
| 酶标二抗 | HRP标记的兔抗鼠和羊抗兔 |
| 显影液，定影液 | 南京蓝格显影公司 |
| PVDF膜 | Minipore(0.22um) |
| 电泳液 | Tirs 3g,甘氨酸14.4g,SDS 1g ,加水至1L |
| 转膜液 | Tirs 3g,甘氨酸14.4g,甲醇200ml,加水至1L |
| 封闭液 | PBS+5%脱脂奶粉，PBS+5%BSA |
| PBST | PBS+0.05%吐温 |
| 10*PBS | 35.4g磷酸氢二钠，2g磷酸二氢钠，45g氯化钠加水至1L。 |
4.2操作规程
4.2.1制胶和制样
(1)制备相应浓度的PAGE胶;
(2)根据实验需求取适量抗原样品，加入2*或5*上样缓冲液，充分混匀后100度水浴10min，然后10000rpm 离心5min。
4.2.2电泳
(1)按SDS-PAGE操作规程装好电泳装置，按实验设计上样，每个泳道最大上样量20ul，预染Marker上样3ul，需要根据蛋白大小确定使用何种Marker。
(2)上样完毕后，接通电源，按胶的不同选取不同的起始电压。自制聚丙烯酰胺凝胶先100V跑完积层胶，再将电压升至120V直到电泳结束。
4.2.3转膜
(1)电泳结束后，将凝胶放置转膜液里浸泡5-10min，PVDF膜在甲醇中浸泡15s,膜成半透明状，在超纯水中冲洗一下，放入转膜液中转膜浸泡后转膜。转膜顺序为：负极-海绵垫-三层滤纸-胶-膜-三层滤纸-海绵垫-正极。如同时操作多张膜需在膜上编号以便区分。
(2)恒流240mA，根据分子量大小确定转膜时间。分子量＞40KD转膜时间1.5-2小时，分子量＜40KD转膜时间1小时，分子量＜20KD转膜时间45min，恒流200mA。
4.2.4 封闭
电转结束后，取出膜用PBST洗涤4次，每次5min。然后置于33度摇床封闭1小时。视情况而定采用封闭液。
4.2.5 一抗孵育
PBST稀释一抗（稀释倍数视情况而定），稀释体积一般3-4ml放于抗体孵育盒中4度过夜，内参可以33度1小时。
4.2.6洗膜
一抗结束后，用PBST洗涤4次，可以33度也可以25度，每次5min（磷酸化抗体可以洗三次，每次5min）。
4.2.7二抗孵育
用5%的牛奶封闭的稀释二抗（1:10000）.膜在二抗中33度1小时。
4.2.8洗膜
二抗结束后，用PBST洗涤4次，可以33度也可以25度，每次5min。
4.2.9 显影
ECL法：
(1)用平板纸吸去膜上的水分，将膜放置于平面上，取等体积的ECL液A和B液混匀后加入膜上反应1min
(2)然后取膜弃去ECL发光液于暗盒中显影，可根据背景及条带的强弱选择不同的曝光时间。
(3)记录好显影时间及配置时间，一般显影液可使用1-2周，定影液2-3周，像信号较弱的，可通过更换显影液加强显影的强。
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