植物烟草体系亚细胞定位案例分析

本文来源于与客户的亚细胞定位的合作案例，介绍了植物烟草体系的亚细胞定位的实验流程与实验所需的仪器耗材，结尾附带实验结果展示。

一、亚细胞定位实验仪器设备

型号	名称	厂商
Nikon C2-ER	激光共聚焦显微镜	Nikon
ZF-258	全自动凝胶成像分析系统	上海嘉鹏科技有限公司
DYY-8D	稳压稳流电泳仪	北京市六一仪器厂
HH-S3	数显恒温水浴锅	金坛市金南仪器
Thermo Sorvall ST16R	离心机	Thermo Scientific

二、亚细胞定位培养基配方

YEB液体培养基成分	含量/L
酵母提取物(BBI life sciences)	4.0 g
甘露醇 (BIOSHARP)	10.0 g
氯化钠(国药集团化学试剂有限公司)	0.1 g
七水硫酸镁(国药集团化学试剂有限公司)	0.2 g
磷酸氢二钾(国药集团化学试剂有限公司)	0.5 g
pH	7.0 ± 0.1

121℃高温蒸汽灭菌20分钟。

三、亚细胞定位实验步骤

1，烟草培养：播种烟草种子若干，12h光照培养，培养一个月即可用于实验；

2，农杆菌培养：将构建好的载体质粒电转化法转入农杆菌（GV3101,EHA105,LB4404等），30℃培养2天；

3，悬浮农杆菌：用接种环将农杆菌从固体培养皿上刮下，接于10ml YEB液体培养基中，170rpm/min培养1h；

4，收集菌体：4000rpm/min，离心4min，去上清；

5，重悬：用10mM MgCl2（含120uM AS）悬浮液重悬菌体，调OD600至0.6左右；

6，注射：挑选生长状况良好的烟草植株，用去枪头的1ml注射器从烟草叶片下表皮注射，并做好标注；

7，培养：将注射完成的烟草植株弱光培养2天，即可观察；

8，观察：取标记的农杆菌注射的烟草叶片，制作成玻片，激光共聚焦显微镜下观察，并拍照。
注：共定位时，将marker质粒转化农杆菌，和构好的载体质粒农杆菌一起悬浮操作，在注射前按1:1比例混合，然后注射烟草叶片。

四、实验结果

叶绿体荧光信号说明：
叶绿体荧光信号激发波长：640nm，发射波长：675nm
GFP信号说明：
绿色荧光蛋白GFP： 激发光488nm，发射光510nm
激光共聚焦型号：Nikon C2-ER

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