实验原理

分子标记是以个体间核苷酸序列变异为基础的遗传标记，是DNA水平遗传多态性的直接反映。

简单序列重复，又称微卫星序列，其串联重复的核心序列为1-6bp,重复单位数目一般10-60个，其多态性主要来源于串联基序数目的不同。其原理是根据串联重复序列设计引物，通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型。

插入缺失(Insertion-Deletion ，InDel),指不同品种(系)在基因组中有小片段的核苷酸序列的插入或缺失，其原理是根据插入缺失位点设计引物，通过PCR反应扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型。

核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism, SNP),指同一位点的不同等位基因之间仅有个别核苷酸的差异。其原理是根据多态性位点设计引物，通过PCR反应扩增出目标片段，利用测序来确定核苷酸差异。

实验目的

利用分子标记可以进行品种的基因型分析，真假杂种鉴定，遗传连锁图谱构建，分子标记辅助选择育种，基因定位、克隆，物种亲缘关系鉴别。

实验试剂

实验试剂
PCR试剂	测序试剂
10 × PCR Buffer (mg2+ Plus)(R10T1，TaKaRa)	EXOI (M0293L, Biolabs)
rTaq(R10T1，TaKaRa)	SAP (D2660A, TaKaRa)
dNTPs Mix(Pharmcia分装)	BigDye (4336913, ABI)
d2H2O	5 X Bufer (4336699, ABI)
	甲酰胺(4311320，ABI)
琼脂糖胶电泳试剂
琼脂糖Agarose (G-10， BIOWEST)	核酸染料GoldView (Amresco 分装)
DNAMarker (DL2000 Plus, BM111,TransGen)	0.5xTBE溶液
聚丙烯酰胺凝胶(PAGE)胶电泳试剂
丙烯酰胺(Acrylamatide, AB1032, Ultra pure, BIO BASIC INC)	过硫酸铵AP (Ammonium persulfate, A3678, Sigma)
甲叉-丙烯酰胺( Bis- Acrylamatide, BB0025, Ultra pure, BIO BASIC INC)	去离子甲酰胺(deionized formamid, F0606，生工生物)
NaOH ( 分析纯，光复)	溴酚蓝(Bromophonel blue, B0126,Sigma)
二甲苯氰(Xylene cyanol FF, X4126,Sigma)	硅化剂(Plusone Repel Silane, 17-1332-01, Amersham. Biosciences)
反硅化剂(Plusone Bind silane, 17-1330-01, Amersham. Biosciences)	TEMED (T9281, Sigma)
95%乙醇(10009134, 分析纯，沪试)	硝酸银(10018461,分析纯，国药化试)
甲醛(83012,分析纯，湖北奥生新材料科技有限公司)	Tis粉(Tis Amino, 7861-- Angus Chemical Company)
硼酸(10004818,分析纯，国药化试)	EDTA (10009717,分析纯，沪试)
尿素(10023218,分析纯，国药化试)	1×TBE溶液
部分试剂配方
40%的丙烯酰胺胶母液配制	过硫酸胺(AP)的配制
丙烯酰胺380g 甲叉一丙烯酰胺20g 加60℃左右的d2H2O定容至1000ml,迅速搅拌至澄清透明。过滤后4℃保存。	终浓度10%，用分析天平称取4gAP粉末，加纯水40 ml,摇匀溶解，4C保存(不要超过2个星期，最好新鲜配制)。
上样用指示剂(10 x loading buffer)配制	5xTBE的配制
甲酰胺(deionized formamid) 500ml	Tris粉 54 g
4 N NaOH 1.32 ml	硼酸(Boric acid) 27.5g
溴酚蓝( Bromophonel blue) 263mg	0.5M EDTA (PH7.9)
二甲苯氰(Xylene cyanol FF) 263mg	加d2H2O至 1000ml
d2H2O 25ml	搅匀后室温保存，0.5和1xTBE溶液用此分别稀释10倍和5倍后用。
混匀后放在摇床上摇12小时，4℃保存。
4%的PAGE胺胶液配制          制一板胶用量     配制40版用量
5xTBE溶液     15ml     600ml
尿素     36.04g     1441.6g
d2H2O      22ml     880ml
实际配置时每次配制40板用量，搅拌过夜后过滤，滤液4℃保存。

实验仪器

PCR仪（ABI9700）

电泳仪(MODEL 250EX, LIFE TECHNOLOGIES)

水平电泳槽(北京六一)

垂直电泳槽(北京六一)

通风橱(2004-SFH, SUNLAB)

凝胶成像系统

测序仪(ABI 3730)

操作步骤

1.PCR 反应

1.1调整模板浓度至~50 ng/ul;

1.2按下列体系配制反应混合液，混匀，加20ul矿物油，离心5秒

Template DNA	2 ul
10x PCR buffer	2.0 ul
dNTPs Mix (2 mM)	1.6 ul
Primer F (10 pM)	0.3 ul
Primer R (10 pM)	0.3 ul
rTaq (5 U/ul)	0.1 ul
Add d2H2O to	20 ul

1.3 PCR反应程序

94℃	4 min					1 cycle
94℃	30 sec	55℃	30 sec	72℃	30sec	35 cycles
72℃	5 min					1 cycle
4℃	1 min
以上退火温度可以根据不同引物适当调整。

1.4检测:加~2 ul 10xLoading buffer,短暂离心;

2.琼脂糖凝胶电泳(适合InDel 标记和多态性片段较大的SSR标记)

2.1用琼脂糖胶将洗净、干燥的制胶板的两端封好，水平放置在工作台上:调整好梳子的高度;

2.2称取1.2 g琼脂糖于120 ml 0.5xTBE中，在微波炉中使琼脂糖颗粒完全溶解，冷却至50°C左右时加入5ul GoldView混匀，倒入制胶板中;

2.3凝胶凝固后(~30min),小心拔去梳子，加入2ul Loadingbuffer至扩增产物中，混匀，取8ul样品依次点入加样孔中，最后一-孔点入5ul DNA Marker;

2.4将制胶板小心放入电泳槽中，打开电泳仪电源，使核酸样品向正极泳动，250V电泳20-30min (根据多态性大小调整);

2.5电泳完成后，切断电源，取出凝胶，清水中短暂漂洗，用保鲜膜包好置于凝胶成像系统中观察照相，读取基因型。

3.PAGE胶电泳(适合-般SSR标记和多态性较小的InDel标记)

3.1.胶板的制备

(1)将玻璃底板和盖板洗净晾干待用:

(2)用5cm见方的滤纸片沾上95%乙醇擦拭底板和盖板3-5遍至玻璃板洁净无污渍，待用:

(3)在通风橱中取1 ml 95%乙醇至1.5 ml离心管，加入2 ul反硅化剂，于涡旋震荡器上混匀，均匀倒在用(2)中95%乙醇擦拭过的底板上，用滤纸片来回擦拭，至无明显液体痕迹，再加入3-5 ml 95%乙醇用一张新的滤纸来回擦拭，以保证反硅化剂在底板上均匀分布;

(4)在通风橱中用胶头滴管吸1 ml硅化剂至用95%乙醇擦拭过的盖板，用滤纸片来回擦拭，至无明显液体痕迹，再加入3-5 ml 95%乙醇用一张新的滤纸来回擦拭，以保证硅化剂在底板上均匀分布:

(5)将底板水平放置(擦过反硅化剂-面朝上)，在两侧放好压条( spacer),将盖板(擦过硅化剂-面朝下)重合在底板上，两边各用两个夹子夹紧;

(6)配制胶液:取60 ml 4% PAGE胶液至烧杯中加入500 μl AP液和50 μlTEMED，用玻璃棒迅速搅勾，往底板和盖板之间的缝隊灌胶，待胶液充满整个玻璃板，插入梳子。胶板制备完后需放置至少1个小时才可用。

3.2. 电泳

将制好的胶板置于水槽中洗去板面上的碎胶，轻轻拔出梳子(注意不要弄破胶面)，用水冲去碎胶，将盖板面朝向电泳槽放入电泳槽中，两边各夹3个夹子，扭紧下部螺丝，加入1xTBE溶液覆盖胶孔，电泳仪设置:电压: 2000V, 电流:200mA,功率: 90W， 预热40分钟后插入梳子点样3-5ul。

3.3. 显影

(1)硝酸银溶液配制:称取2 g硝酸银于试剂瓶中，加入2000 ml蒸馏水，溶解，倒入塑料盆中，盖上盖子避光;

(2) NaOH溶液配制:称取40 g NaOH于试剂瓶中，加入2000 ml蒸馏水溶解，加入2瓶盖甲醛溶液，混匀倒入另-一个塑料盆中，盖上盖子，置于通风橱中;(3)取下电泳完毕的胶板，撬开盖板，将底板在蒸馏水中漂洗一 遍后置入硝酸银溶液中浸泡10分钟，然后取出在蒸馏水中漂洗一遍，再置入含甲醛的NaOH溶液中，至带型清晰显出时捞出，放于清水中漂洗4-5遍，捞出平放至胶面干燥,即可读带。

4.SNP标记检测

4.1. PCR扩增

参照前面一般PCR扩增。

4.2. PCR产物检测

制备琼脂糖胶(1%)，检测PCR扩增产物。特异性扩增带与预期大小相符，亮度(浓度)与Marker (DL 2000, ~50 ng/uI)相仿即可。

4.3. PCR产物消化处理

PCR产物	5ul
10×SAP Buffer	0.3ul	①37℃水浴1h
25mM MgcL2	0.18ul	②80%水浴20min灭活
Exol(20U/ul)	0.25ul	③1Kb左右的片段取3ul作DNA测序
模板
SAP(2U/ul)	0.13ul	注：取PCR产物尽量避免取到上层矿物
油	Add d2H2O to	8ul

4.4. 测序反应

DNA模板	3ul	反应程序
Primer(单引物)	0.16ul	93℃ 3min
5×buffer	1.75ul	96℃ 10sec,50℃ 10sec,60℃ 4min,33-35Cycles
BigDye	0.5ul	25℃ 10min
Add d2H2O to	10ul

4.5. 测序产物的纯化

(1)1ml95%乙醇中加入40ul 3 M NaAC,混匀后按26ul/孔分装进测序样品，混匀，放置15min，3000g，离心30min，弃上清；

(2)分装75%乙醇，75ul/孔，3000g，离心30min；

(3)弃上清，于超净工作台吹干，约5 min;

(4)分装甲酰胺，7 ul/孔，94℃变性(~5 min),置于冰上冷却。

4.6.上机(ABI3730测序仪)测序 按测序仪操作说明进行。

注意事项

1. 做PAGE胶时:待盖板和底板擦干净完毕后，在倒胶之前，需用梳子插入两玻璃板之间，检查玻璃板之间空隙是否均匀;若梳子不能顺利插入空隙，务必调整盖板和底板组合，以免倒胶时胶的厚度不均匀或者是梳子插不进去的情况出现。

2. PCR扩增时:选择SSR引物进行PCR扩增时，引物的退火温度和PCR产物大小，以便以后点样。

3. 点样时:为了确定点样时间和样品点样间隔，应首先用两亲本进行PCR扩增，然后就可以根据PCR产物大小和SSR引物在两亲本之间多态性大小，确定点样顺序和时间间隔。当PCR产物有拖带时也可以在点样之间将PCR产物用96℃ 3min进行变性，这样效果会好一些。

4. 显影时:当用甲醛显影时，不能在显影液中放时间太久，不然容易脱胶;待显影完毕后，可以在水中多漂洗数次，可以去除甲醛的气味同时还可以避免胶被氧化风干。

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