实验原理:

根据抗原与抗体的特异性结合原理，结合透射电镜对细胞超微结构的成像技术，利用胶体金颗粒具有高电子密度的特性，金标抗体结合处在透射电镜下呈现黑色颗粒。

实验目的:

根据金标抗体在细胞中的位置，来确定目的蛋白质(抗原)在细胞中的分布。

试剂和仪器
试剂：
0.01M pH7.2 PBS缓冲液的配制: NaH2PO42H2O 0.175g; Na2HPO412H2O 1.71g; NaCl 3.51g;溶于400ml蒸馏水中。
乙醇(国药试剂)，多聚甲醛、25%戊二醛(进口品质)
固定剂: 4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的混合固定液配制:秤取多聚甲醛粉末1g,溶于49ml0.01M PBS中。再加入1M NaOH溶液并放60℃水浴中促进多聚甲醛溶解。大约30min后，白色粉末溶解。待溶液冷却后再加入25%戊二醛1ml,混匀即可。
脱水剂:乙醇的水溶液。
包埋剂: LOWICRYL K4M Embedding Kit, Cat.#14330 ( Electron MicroscopyScience, USA)的配制(5个样品的用量): Cross link A 4.05g; Monomer B 25.95g;InitatorC0.15g。取以上三组分加入干燥的烧杯中，用玻璃棒将粉末压碎并轻轻搅拌5min,混匀树脂即可用。
PBST的配制: NaH2PO42H2O 0.255g; Na2HPO412H2O 3.27g; NaCI 4.25g;溶于500ml蒸馏水中。再加入0.25ml TWEEN20。
阻断液的配制: BSA 0.02g; Glycine 0.75g;溶于20ml PBST中。
醋酸铀染液:使用双蒸水将醋酸铀配成0.5%的水溶液，醋酸铀溶解需15-30min。
仪器:
冰箱
紫外聚合仪(Leica EMAS2, Gemay)
玻璃刀制刀机(Leica KMR3, Gemany)
钻石刀(超薄级，DITOME, Switerand)
超薄切片机(Leica uc6, Germany)
透射电子显微镜(H-7650, Japan)
用具:
2ml离心管、手术剪刀、眼科镊子、量筒、烧杯、吸管、注射器、牙签、液氮50L、包埋模具(glin胶囊)、酒精灯、玻璃条、铜网、铜网镊子、细毛笔、滤纸。

实验步骤：

1.取样:以下所有操作均在冰上进行。将水稻组织切成小块，每份样品至少取10个小块，迅速置于预冷的4%多聚甲醛和0.5%戊二醛的混合固定液中，抽真空至样品沉底后再继续抽2h。 4℃冰上可以保存一周。 不同水稻组织取样要求:组织要在固定液中剪切。叶片切成1mmx1mm小块，花药两端剪开，幼嫩组织可取大些但不能超过3 mm³,其他含硅的组织剪的越小越好。

2.脱水:所有乙醇梯度(除30%乙醇)均需要提前半小时预冷到-20℃。30%乙醇在4℃冰上操作，其他均在-20℃操作。具体流程如下: 30%乙醇1h→50%乙醇 1h→70%乙醇 1h (此步可过夜) →80%乙醇 30min→85%乙醇 20min→90%乙醇 20min→95%乙醇 20min→100%乙醇 1h→100%乙醇1h

3.渗透:所有步骤均在-20℃操作。树脂K4M与乙醇的配比(体积比)及渗透时间流程如下: 3:1 12h→2: 1 12h→1:1 12h→1: 2 12h→1: 3 12h→纯树脂K4M 12h

4.包埋聚合: Leica EMAFS2紫外聚合仪提前加入50L液氮，将样品室预冷到-20℃。将胶囊加满树脂K4M,用预冷的牙签将祥品挑进胶囊中，盖紧胶囊。开始运行紫外聚合程序-20℃ UV 48h, 25℃ UV 48h.聚合后，祥品编号好4℃干燥器中保存。

5.超薄切片:将包埋块粗修暴露出样品，再用玻璃刀细修成梯形;安装钻石刀，对刀，进刀进行切片，将样品切成厚度为60-80nm的切片，镍网捞片，自然烘干。

以下标记工作均在湿盒内操作。

6.阻断:将镍网倒扣在阻断液液滴上20min。

7.清洗:将阻断液上的镍网转移到PBST液滴上，洗2次，每次10min。

8.一抗孵育: 1: 50稀释-抗(1μl抗体+49uIPBST),将镍网转移到一抗的液滴上，4℃冰箱过夜。同时用PBST代替一抗做阴性对照。

9.清洗:清洗:将阻断液上的镍网转移到PBST液滴上，洗3次，每次10min10.晾干:将清洗后的镍网吸干并晾在小皿的滤纸上，镍网正面向上，盖上平皿盖子，以免粘灰。晾干30min,也可放置更久。

11.二抗孵育: 1:50 稀释二抗，将镍网转移到二抗的液滴上，37°C孵育1h。12.清洗:将阻断液上的镍网转移到PBST液滴上，洗6次，每次10min。最后，用滤纸吸干镍网上的水。

13.染色:在干净的培养ml内放置蜡板，把醋酸铀液滴到蜡板上，将镍网覆于染液上30min,然后用双蒸水冲洗、吸干。

14.透射电镜观察:将铜网固定于样品杆上，样品杆插入透射电镜，加高压，同时打开CCD成像系统。低倍找到切片上的样品，选择感兴趣的区域进行聚焦成像，CCD 成像系统获得相应的数码照片。

注意事项:

1.金标成功标记的关键在于一抗与切片上抗原的结合能力及特异性，westernblot是检验一抗特异性及结合能力的重要标准。

2.一抗浓度和二抗浓度要根据每次标记后的图片结果做调整和摸索。一般情况下，金标中一抗浓度要比westerm blot中的要高(撰写者实验经验)。二抗浓度根据推荐的稀释比进行稀释。

您可能对以下内容感兴趣:

•植物过表达、干扰表达载体构建

•粮食作物（水稻等）转基因