反向遗传学研究

　　经典遗传学从生物的表型、性状到遗传物质来研究生命的发生与发展规律,而反向遗传学是直接从生物的遗传物质出发来阐述生物生命发生的本质现象, 与之相关的各种技术统称为反向遗传学技术(Reverse Genetic Manipulation)。这项技术现在已广泛应用于生命科学的各个研究领域。

一、全长cDNA的克隆技术

　　反向遗传学操作技术是在cDNA水平上进行操作的, 因此生物基因组全长cDNA的克隆就显得至关重要。在分子生物学技术飞速发展的今天, 尤其是在真核生物基因组学领域 , 获得全长cDNA的技术更是日趋成熟和多样化, 原核生物的基因组结构比较简单, 其全长cDNA的克隆可借鉴于真核生物,目前真核生物基因组全长cDNA的克隆技术常用的方法有以下几种。

二、构建全长cDNA文库, 从中筛选含有全长cD NA的克隆

　　

　　目前有多种构建cDNA文库的方法可供选择, 但其基本原理都是相似的。即oligo(dT)结合的纤维素、磁珠或其他固体颗粒, 分离纯化的 mRNA(或含有poly(A)尾巴的基因组) ,加入酶和反应底物直接进行cDNA单链及双链的合成 , 然后再将cDNA进行修饰。削平末端加上接头, 磷酸化后, 使之与合适载体相连。有：

　　

1.cDNA 文库固相构建法；
　　2. oligo 2 capping 法；
　　3.CAPture 法；
　　4. Cap trapper 法

三、快速cDNA末端扩增方法(RACE)

　　RACE是采用PCR技术, 由已知的cDNA序列来扩增出完整的cDNA的3′和5′末端的快速方法,被称为单边PCR和锚定PCR。现在已经有现成的试剂盒提供给研究者选择使用, 不同的RACE试剂盒可能会采用不同的策略, 但是其基本原理都是一致的。

四、利用穿梭载体获得全长cDNA

　　这是oligo-capping技术的基础上加以改进而发明的一种载体引物法。其最大特点是省略了PCR和亚克隆等步骤。而且用这种方法得到的全长cDNA既能在体外表达, 又能在哺乳动物细胞中表达。该方法的要点是构建一种穿梭载体 , 然后将此载体作成引物直接连在mRNA的3′末端, 做反转录生成cDNA, 用所引入的限制性酶切位点消化后, 使之自连, 得到全长的cDNA 。

五、感染性分子克隆的构建

　　在克隆到RNA病毒的全长cDNA分子之后, 可以通过合适的方法转染宿主细胞以回收具有感染性的病毒粒子, 大体上有两种途径可达此目的。
（1）将全长cDNA克隆到具有强启动子的质粒载体上, 在体外用RNA聚合酶转录系统进行体外转录得到感染性转录本 (RNA), 再用转录产物感染宿主细胞, 回收感染性病毒粒子。
（2）直接用含有cDNA的质粒(也必须具有强的启动子如CMV启动子)导入宿主体内, 利用宿主的RNA聚合酶及转录系统在体内发生转录生成具有感染性的病毒RNA, 进而装配成病毒粒子。

 

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