影响植物组织蛋白质纯化的因素

植物在蛋白质纯化方面存在一些特殊的问题，使得单位体积蛋白得率比动物或原核生物要低，而且组织的破坏、干扰纯化和具有氧化作用的天然物质的存在会影响酶的活性。谨慎选择材料来源以及恰当的组织破碎方法就显得很重要。一旦蛋白质成为可分离的形式，植物蛋白就可像其他蛋白一样，采用一般的纯化方法进行处理。

蛋白质浓度低

与大部分其他生物不同，植物的大量固体物质并不是蛋白质，而是包括淀粉、纤维素、果胶和半纤维素以及多酚等在内的其他大分子物质。最初的均质化必须在大量的缓冲液中进行，以便初步过滤。大量的不溶性物质由于凝胶作用或者简单的吸附作用会影响过滤，因此最初只能得到低浓度的蛋白质，需要经过沉淀或浓缩。均质化后硫酸铵沉淀、PEG沉淀对于植物蛋白质很常用。如果采用超滤浓缩，应考虑植物蛋白与膜结合的能力，以免产生负面影响。

蛋白质水解

植物蛋白质纯化有时会出现蛋白质水解的问题，常伴有初始蛋白质浓度的降低，这可能由于初始步骤操作时间过长，或者存在蛋白酶的作用。植物含有的主要蛋白水解酶类包括丝氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶和金属蛋白酶，可选用相应的抑制剂。1mmol/L的PMSF适用于丝氨酸蛋白酶的抑制（表1）。

抑制和褐变

许多植物组织富含氧化酶，它们作用于内源底物，产生活性产物，与酶反应后使其钝化，这可能是植物天然防御机制的一部分。多酚氧化酶存在于许多植物中，如马铃薯、苹果、香蕉和甜菜，从而产生褐变反应，特别是当游离酪氨酸存在时。其他植物如豆类，组织破碎时所大量释放的过氧化物酶也会引起褐变反应。通过除去底物或抑制氧化酶可以减少褐变反应。阳离子树脂 （如Dowe ×1 ×2）或疏水作用树脂 （如Am berlite XAD-2）可用于去除反应底物。反应抑制剂可以使用硫醇、2-巯基乙醇或二硫苏糖醇，也可选择抗坏血酸 （但应注意对均质缓冲液pH的影响）或偏亚硫酸氢钠 （表1）。

表1 植物组织提取缓冲液常用的保护剂
保护剂	最终浓度	保护剂	最终浓度
渗压剂 蔗糖 山梨醇 甘油	0.33-0.5mol/L 0.33mol/L 10%（体积分数）	Dowe ×1 ×2树脂 偏亚硫酸氢钠	1%-5%(10-50g/L) 1-5mmol/L
抗氧化剂 2-巯基乙醇 二硫苏糖醇 抗坏血酸（维生素C）	1-10mmol/L 1-10mmol/L 1-20mmol/L	蛋白酶抑制剂 牛血清白蛋白 PMSF 对氯汞苯甲酸 EDTA 亮肽素 抑胃肽 抑凝乳蛋白酶素	1%-5%(10-50g/L) 1mmol/L 1mmol/L 1mmol/L 1mmol/L 10-100umol/L 1umol/L 10-100umol/L
酚氧化抑制剂 PVP 苯酚甲醛离子交换树脂XDA-2	1%-5%(10-50g/L) 1%-5%(10-50g/L)

 

您可能对以下内容感兴趣：

•植物激素检测服务

•植物激素检测常见问题