作者：陈海波 来源：光明日报

中华家系1号基因组和转录组标准物质发布

基因测序可靠性有了计量支撑

本报北京8月26日电（记者陈海波）基因测序有多准确，现在有了计量标准。中国计量科学研究院（以下简称“中国计量院”）和复旦大学历时六年半，成功研制中华家系1号（同卵双胞胎家庭）人源B淋巴细胞系全基因组DNA序列和全转录组RNA标准物质，在日前召开的基因组测试质量及计量标准交流会上正式发布。该系列标准物质填补了国内外空白，将为基因测序的可靠性提供保障。

标准物质是指具有足够均匀性和稳定特性的物质，可作为生物计量的“尺子”。中国计量院和复旦大学组成的项目组，突破传统的定量标准物质研制模式，在生命科学领域开创了一种全新的定量组学标准物质研制模式，研制完成上述中华家系1号系列标准物质。这是中华基因组精标准计划首批国家一级标准物质，该计划由中国计量院启动，旨在研制中国人自己的基因组标准物质，建立国家基因科学基准、基因组研究的权威标准等。

“中华家系1号系列标准物质将为基因组测序数据质量的可靠性和测序行业的高质量发展，提供有力的计量支撑。”中国科学院院士杨维才在上述会议上指出。

中国计量院院长方向认为，中华家系1号系列标准物质对未来满足生命科学领域的测量一致性、测量标准、生物计量体系建设等需求，具有重要作用。它不仅是生物计量和标准物质研究领域一个开创性的工作，而且是标准物质评审领域的一个突破。

目前，中华家系1号系列标准物质已被国家卫健委临床检验中心用于开展全国临床和科研实验室外显子测序室间的质量评价。专家认为，随着该系列标准物质的进一步推广应用，势必在提升基因测序质量、保障基因测序数据可靠、提高基因诊断准确率方面发挥更大作用。

因此，如果知道细胞不同时间的基因表达的变化，就能够了解细胞的过去、现在和未来。

当前，单细胞转录组测序技术是了解细胞状态的重要手段，就像看一张“高清照片”，通过单细胞测序能够看清细胞现在所有基因的表达状态。但是这些技术在理解细胞状态“电影”般的动态变化上却有很大的挑战。

“利用单细胞转录组测序技术来观测细胞状态的前提，是需要将细胞裂解，提取其中的RNA来测定每个基因表达量的高低，但这样就不能避免地杀死了细胞。”陈万泽说道，“使用单细胞测序技术，也只能了解到一个细胞当下的状态，却不能获得它的过去，也无法知晓它将来的功能。”

通过近七年的努力，陈万泽与合作者开发了活细胞转录组测序技术Live-seq，其核心是通过对活细胞中的部分细胞质进行微创提取，并对极其微量的细胞质RNA进行扩增，实现在进行单细胞转录组测序后，依旧保持细胞的存活和功能，从而可以跟踪细胞的动态变化。

论文通讯作者、瑞士洛桑联邦理工学院教授Bart Deplancke表示，该技术兼具全基因表达分辨率和动态解析能力，是目前对单细胞转录组直接动态测量、偶联细胞现有状态和其后续表型的唯一解决方案。

两次碰壁，终于“钓”出RNA

如何在不杀死细胞的前提下，看到细胞的动态变化？

“我们首先想到的是外泌体，它是细胞向外面吐出来的小泡，里面有蛋白、RNA等物质。如果我们把单个细胞的外泌体都收集起来，再对其中的RNA进行测量，或许就可以在一定程度上反映细胞状态而又不杀死细胞。”陈万泽说道。

单个细胞中仅有10 pg（皮克）的RNA，这相当于一克的一千亿分之一的重量，而细胞分泌的外泌体中的RNA更是少之又少。研究团队设计了微流控芯片来完成单细胞捕获、外泌体收集等过程，发现由于外泌体中的RNA数量太少，根本无法实现单细胞分子水平的观测。

随后，陈万泽尝试利用在生命科学领域非常小众的原子力显微镜，它有一个很尖的硅探针，多用来检测物质表面性质。研究团队通过对探针进行表面活化、修饰、洗脱等改造后，让其能够把细胞中的RNA“钓”出来。

“这种探针很细，对细胞的损伤很小，就像‘鱼钩’一样，改造后可以把细胞中的RNA‘钓’出来，又能保证细胞继续存活。我们改造了数十个探针后，结果只在两个细胞上成功“钓”到了基因。”陈万泽回忆道，当时购买一个原子力显微镜探针需要800美元，研究成本太高，成功率太低，让这项研究再次面临阻碍。

瑞士洛桑联邦理工学院学科交叉氛围浓厚，在一次偶然的学术交流中，陈万泽与导师了解到，瑞士苏黎世联邦理工学院的Julia Vorholt实验室开发了一种特殊的原子力显微镜，能够吸出一部分的细胞质。

一番交流后，两个课题组一拍即合，展开了联合攻关。联合团队对一系列的实验过程进行了优化，包括解决了RNA降解、低温下的快速操作、超微量样品转移、采样通道清洗避免交叉污染、图像下追踪细胞等多种问题，以保证实验结果的可靠性。

联合团队利用重新改造后的Live-seq，对五种类型共295个细胞进行了测序，发现Live-seq能够有效区分不同类型的细胞，且平均每个细胞能检测到约4112个基因的表达信息。

仅对少量的细胞质进行测序，是否就能代表细胞的状态？

“我们平行比较了单细胞测序结果，发现活细胞测序结果与普通的单细胞测序结果高度吻合，证明Live-seq能够很好地体现细胞的全转录组状态。”陈万泽说道。

细胞的存活率又如何保证呢？

“原子力探针尖端只有几百个纳米大小，而且能和细胞膜密封，对细胞损伤极小。吸取约5%至50%的细胞质后，细胞体积可以快速恢复到正常水平，存活率在85%至89%之间，细胞能进行正常分裂。通过一系列的功能分析和分子表征，我们没有发现Live-seq对细胞的状态有显著的影响。”陈万泽表示。

对此，审稿人在评审意见中也写道：“由于细胞测序后仍旧存活，Live-seq首次实现对同一个细胞全基因表达的连续测量。”

细胞测序史从“高清图片”到“高清电影”的跨越

在细胞观测技术史上，显微成像和基因编辑介导的分子记录等技术不仅能观察细胞水平的生长、分裂、死亡等过程，还能观测细胞中的单个或几个基因指标。

2009年，单细胞转录组测序技术为更系统全面地定义细胞类型和状态提供了变革性手段。但人们仍然只能观察到细胞的静态状态，无法连续观测细胞的动态或者检查细胞后续的表型。

如果将利用单细胞转录组测序技术观测细胞比喻为看一张细胞在分子水平的高清图片，那么利用Live-seq观测细胞，就好比看一部高清电影，能够看见细胞的“前世今生”。

“Live-seq可以回答细胞怎样的过去决定了它的现在，不只知道细胞中为何存在差异，还知道这些差异从何而来。”陈万泽介绍道。

在验证实验中，研究团队利用Live-seq直接测定了同一个巨噬细胞在不同时间的状态变化，发现细胞起始状态的少数基因的表达差异和噪音（如Nfkbia、Gsn等）是决定细胞后续反应差异的重要原因。对应地，普通的单细胞转录组无法找到这些规律。

陈万泽表示，尽管Live-seq仍然存在诸多挑战，需要进一步完善，比如低通量、暂不能在体内应用、在高度极化且mRNA分布不均的细胞中无法实现全细胞转录组测序、对细胞更多次的采样还需进一步研究等，但该技术首次实现了活细胞连续观测，也为单细胞测序技术发展带来了更多可能性。未来，团队将进一步进行深入研究，提高Live-seq技术的可用性。

　

本文转载自《中国科学报》

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