一、概述

在酵母双杂交技术的帮助下，研究者揭示并阐明了不少新的蛋白质-蛋白质相互作用，许多先前不明白的调控通路得以明确。双杂交系统利用转录因子(酵母增强子Gal4)的双功能特性，通过报告基因的表达来检测蛋白质相互作用。一旦确认了双杂交相互作用的存在，就可以通过点突变或随机突变让其中一个蛋白质发生突变，使其相互作用的能力下降。用这种策略设计的突变株可以用来研究相互作用的生物学意义，还能用于鉴定相互作用的氨基酸残基。这就是反向双杂交技术。本文介绍的反向杂交方法，可以使大肠杆菌热稳定毒素(Escherichia coli heat - labile toxin, LTA1)的催化亚基产生相互作用缺失的突变，降低与其蛋白质辅助因子一活性状态 (GTP- 结合)的人ARF3之间的结合能力。

蛋白质相互作用是细胞内部生化调控网络的关键。在酵母双杂交技术的帮助下，研究者揭示并阐明了不少新的蛋白质蛋白质相互作用，许多先前不明白的调控通路得以明确。双杂交系统利用转录因子(如Gal4或LexA)的双功能特性检测蛋白质相互作用。转录因子的DNA结合结构域和转录激活结构域分别表达蛋白质蛋白质相互作用:方法与应用融合蛋白，但只有在融合蛋白的其他部分具有相互作用时才可以促进转录(见图1和注释1)。双杂交文库的筛选已经确认了很多的相互作用蛋白，而基于蛋白质组的筛选也显著增加了可能存在的蛋白相互作用的数目。

图1 在酵母双杂交系统中报告基因的表达(例如lacZ)取决于两个融合蛋白的相互作用，而通过点突变可以破坏这两个融合蛋白之间的相互作用。左边图中绘出了Gal4蛋白，两个待研究的相互作用蛋白，以及所产生的融合蛋白。蛋白质中的“x”表示点突变。两个融合蛋白的相互作用产生的转录因子能够结合Gal4 上游激活序列(upstream activating sequence,UAS)，从而促进下游的报告基因(lacZ) 的转录。两个融合蛋白中的任一个发生降低融合蛋白结合能力的点突变，都将减弱甚至阻止报告基因的表达。表达水平以β -半乳糖苷酶活性表示。

通过双杂交方法确认存在相互作用之后，我们就可以让其中一个蛋白质发生突变，使结合力下降。产生并且应用这种突变体的方法，就是反向双杂交方法。这种相互作用缺损的突变体非常关键，能够用于检测某种特定蛋白质相互作用在活细胞中的功能意义，也可以用来得到一张蛋白质相互作用的功能域图，也可以不依赖内源性蛋白质来制造一些相互作用蛋白质的突变体配对。当目的蛋白质与许多蛋白质相互作用时，这种方法显得尤为有效，因为双杂交筛选可以确定哪些突变体与某原先相互作用的蛋白质不再发生相互作用，但与其他的蛋白质仍然保持相互作用，即出现特异性相互作用缺失性突变。本文介绍的反向杂交方法，可以使大肠杆菌热不稳定毒素(Escherichia coli heat-labile toxin, LTA1)的催化亚基产生相互作用缺失的突变，降低与其活性状态(GTP -结合)的蛋白质辅助因子人ARF3, ( [Q71L] ARF3)之间的结合能力。

此方法的主要特征包括基于PCR对任-一编码区内的特定区域做随机突变，通过免疫印迹技术检测融合蛋白上的标签来确定全长突变体与野生蛋白表达在同一水平。大概是扩增250个碱基对产生一个突变。PCR反应中可以利用调节底物核昔酸浓度或锰离子浓度来控制突变的程度。虽然在突变蛋白质的C-末端融合选择性标签，可用来筛选全长蛋白，这对于高通量的筛选非常有意义，而且能加速筛选速度一反 向双杂交系统限速环节，但我们还是更倾向于应用免疫印迹来估计蛋白的表达和确保表达蛋白质的全长。用下面描述的方法，我们在一周之内就可以得到好几百个β-半乳糖苷酶活性降低的菌落，其中一般有25% ~50%是由全长蛋白的点突变得来的，具有进一步分析的价值。这样可以得到几十个突变体，可以阐明它们与众多的影响因子之间的作用，并且可以在一月之内完成测序。

当数据是阴性结果时，不能等同于相互作用的缺失，这是实验体系中的局限性。然而，与一个蛋白质的相互作用丧失而与其他相关蛋白质仍保持相互作用，这一特点为监测细胞内部活动提供了一个有力的手段。另外，让某个蛋白质发生丧失结合力的突变之后，再使其相对结合蛋白质发生突变，就更容易筛选其中恢复结合能力的突变体。这些突变体可以为活细胞的特异性功能提供些有力的证据。这些突变体可能与野生型蛋白质之间不具有结合能力，可以避免细胞研究中内源性蛋白质带来的干扰或复杂化问题，具有独特的优势。当然，反向双杂交方法得到的数据和结论还可以和其他技术进行交叉印证，从而增强说服力。

二、材料

材料
1. pACT2载体: 2μg质粒带有选择性LEU2基因和ADH1启动子启动表达Gal4p(Gal4p区域Ⅱ，768~881个氨基酸)激活结构域后面有HA标签序列、插人目的蛋白开放读码框的位点和ADH1终止子。
2. pBG4D载体: 2μg 带有选择性TRP3基因和Gal4 DNA结合结构域的质粒，后面有HA标签，使Gal4- BD可加入任意插人的开放读码框的3’末端，ADH1启动子可促进表达融合蛋白。pBG4D由Robert M. Brasas从pAS1 - CYH质粒亚克隆SacⅠ/HindⅢ片段至D133获得。
3.酵母菌株Y190 (MAT (gal4 gal80 his3 trpl - 901 ade2- 101ura3一52 leu2- 3，112 + URA3: GAL (UAS)一HIS3cyhR)由Steve Elledge友情提供。
4. Whatman滤纸1号。
5.硝化纤维素滤器(Schleiche & Schuell Protran, 82mm)。
6. HA单克隆抗体12CA5 (Boehringer)， 稀释成1 : 1000 (终浓度1μg/ ml)用于免疫印迹。
7. X- gal:储存浓度为100mg/ml溶解于N, N-二甲基甲酰胺。
8.低浓度的dATP核酸混合物: 2.5mmol/L dCTP, 2.5mmol/LdGTP, 2.5mmol/L dTTP, 0.625mmol/L dATP,溶于水。
9. Taq聚合酶。
10.合成的基本培养基、完全培养基和缺陷培养基。基本培养基(SD):每升1. 5g缺乏氨基酸的酵母氮源(Difco)、 20g葡萄糖、5g (NH4)2SO4。完全培养基:每升培养液中加入20mg腺嘌呤、20mg组氨酸、20mg 蛋氨酸、20mg 色氨酸、20mg尿嘧啶、30mg亮氨酸、30mg 赖氨酸，需要缺陷培养基时就把相应的氨基酸去掉，例如SD - Leu Trp。
11. SD琼脂培养基，在SD培养液中每升加入20g琼脂(Difco)。
12. SD- Leu/放线菌酮: SD- Leu含有2.5μg/ml的放线菌酮。
13.琼脂糖凝胶和DNA测序设备。
14. SDS - PAGE ( sodium dodecylsulfate polyacrylamide gelelectrophoresis)和蛋白电转染设备，用于免疫印迹。
15. Z -缓冲液: 60mmol/L Na2 HPO4, 40mmol/L NaH2 PO4，10mmol/L KCl, 2mmol/L MgSO4, pH 7.0。
16. PCR诱变所用到的寡聚核苷酸引物: #827 (同义引物): GCGTATAACGCGTTTGGAATC,结合pACT2 MCS 5’端的大约70个碱基对。 #828 (反义引物): GAGATGGTGCACGATGCACAG，结合pACT2 MCS 3'端的大约70个碱基对。
17.测序寡聚核苷酸: # 1042 (同义引物): GCTTACCCATACGATGTTCCA,结合pACT2MCS的5'端。 #1043 (反义引物): TGAACTTGCGGGGTTTTTCAG，结合pACT2MCS的3’端。
18.DNA纯化试剂盒(如:Qiagen小量质粒提取试剂盒、QiaQuick凝胶回收试剂盒、Wizard PCR纯化试剂盒)。
19. pAB157:质粒，通过插人pBG4D的BamHⅠ位点，能够编码C-末端含有Gal4- BD的[Q71L] ARF3,直接表达[Q71L] ARF3 - BD。
20. pXJ12: 质粒，带有E. coli热不稳定毒素(LTA1) 催化亚单位(A1)的开放读码框，该读码框克隆到Nco I和BamH Ⅰ位点上，与Gal4- AD相连，可以直接表达AD- LTA1 (见图2)。
21. YAB457: 源自Y190的酵母品系，带有pAB157质粒，表达[Q71L] ARF3 - BD。
22. SOS: 3.33g/L酵母提取物，6.66g/L葡萄糖，6.66g/L蛋白胨，6.5mmol/L的CaCl2。
23. TE: 10mmol/L Tris- HCI， pH 8.0 和1mmol/L EDTA,pH 8.0。
24.0.1mol/L醋酸锂溶于TE缓冲液。
25. LIiOAc/PEG溶液: 40% (w/v) PEG 3350溶于0.1mol/L醋酸锂TE缓冲液。
26.超声处理过的鲱鱼精子DNA, 10mg/ml。
27. STES: 500mmol/L NaCl、200mmol/L Tris- HCI、pH 7. 6、10mmol/L EDTA,和1% SDS。
28.酚/氯仿: 50%酚50%氯仿。
29.氯仿。
30. PCR缓冲液(1 X): 10mmol/L Tris一HCI、 pH 8.3、50mmol/L KCl、0. 001%凝胶，从10X溶液稀释而成。

图2 应用随机PCR突变技术和缺口修复技术产生大量的酵母突变体，以用于反向双杂交的筛选。在扩增pXJ12质粒编码区LTA1时，在PCR特定突变区域50碱基对外设计引物，以便产生末端与接口处于有缺口质粒一样的突变片段，如下面所示。在严格性降低的条件下做PCR,提高了聚合酶的出错率。需要注意的是，DNA的任何区域都可能作为突变靶点。突变的PCR产物和有缺口的pACT2质粒经过限制酶切共转化到酵母菌里，可以通过同源重组实现质粒的修复。当转化到表达[Q71L] ARF3- BD融合蛋白的酵母菌株中时，可以利用菌落β -半乳糖苷酶实验检测转化株相互作用缺失的情况.

三、方法

①PCR介导的LTA1的随机突变，
②LTA1的突变质粒和pACT2空载体共转染人YAB457酵母菌以得到共表达LTA- AD突变体和[Q71L] ARF3融合蛋白的菌落，
③通过菌落β-半乳糖苷酶分析筛选出缺失相互作用的菌落，
④提取表达突变体LTA1的质粒，
⑤测序缺失相互作用的LTA1突变体。这些方法的前提都是要证实某种双杂交相互作用的存在，例如质粒pXJ12 (AD- LTA1)的蛋白产物和pAB157 ( [Q71L] ARF3-BD)的蛋白产物之间的相互作用。

3.1突变底物的产生

3.1.1 LTA1 的突变

这个方法利用了Taq聚合酶没有校正功能、低保真、在DNA任何区域(这里是AD- LTA1质粒的LTA1编码区)都有可能产生随机突变的特点(见图2和注释2)。

在提高聚合酶出错率的条件下，从引物# 827 # 828做pXJ12的PCR扩增来得到LTA1的突变片段。此处所谓出错率高的培养条件包括:加人MnCl₂,调低dATP相对其他核苷酸的浓度，如前所述。50ul的PCR反应包括:1.5mmol/L MgCl₂、0.05mmol/L MnCl₂、0.25 mmol/L dCTP、0. 25 mmol/L dGTP、0. 25 mmol/L TTP, 0. 0625 mmol/L dATP、2pmol/L 引物# 827、2pmol/L引物# 828、1pl Taq聚合酶(0. 05U/pI)、25ng的pXJ12溶于1XPCR缓冲液中。

PCR扩增/突变要经过25个循环，每个循环前要有个变性步骤(94℃，15秒)，退火温度为55℃ (15 秒)延伸温度为72℃(如果产物少于1kb则为1分钟)。依照厂家说明书用Wizard PCRCleanup试剂盒(Promega) 对产物进行纯化。扩增产生纯化的PCR产物，其LTA1编码区含有随机突变，另外还有大约80个碱基对的pACT2来源的DNA分别位于开放读码框的上下游。在此条件下的PCR产物会比通常要少，不过对后面的步骤来说已经足够了。

3.1.2制备有缺口的质粒(pACT2)

pXJ12经过NcoI和XhoI酶切得到有缺口的质粒(见注释3)。所得到的线性化的8kb的载体用QiaQuick凝胶提取试剂盒(Qiagen)从含1%琼脂糖的凝胶中回收得到。

3.1.3估计载体和 PCR产物的浓度

纯化后的有缺口的载体(pACT2来源)的浓度的估计方法是:在1%琼脂糖中对每个样品的溴化乙啶荧光强度与含量已知的同样大小的λHind Ⅲ DNA标记物荧光密度作比较。

3.2缺口载体和 PCR产物的共转化

利用在酵母细胞中高水平的同源重组，可将突变的开放读码框插人到缺口载体中。缺口载体和PCR产物(每个末端包含> 50 个碱基对的识别区域)在酵母中共转化的效率大约为单独环状质粒转化效率的50% (见图2和注释4)。

1.接种50ml YAB457的SD- Trp平板上，30°C培养到OD₆₀₀值约0.6。

2.1000g 离心5min收获细胞。

3.将细胞重悬于TE缓冲液，再次离心收获细胞。

4.用含0.1mol/L醋酸锂的TE洗细胞，再次离心收集细胞。

5.将细胞重悬于0.5ml含0.1mol/L的醋酸锂的TE。

6.取5个灭菌的离心管，每个分装100μl 细胞悬液。

7.每管加入5pl新鲜已超声已煮沸过的鲱鱼精DNA和0.7ml的LiOAc/PEG溶液。能提高单链DNA载体的转化频率。

8.每管加入转化DNA (线状载体和PCR产物)。使用等摩尔量的线状载体和PCR产物。DNA的量可随实验的转化频率而调整，预计每个100mm的培养板要产生400~ 600个转化子，一般每次转化要加0.1~1μg (见注释4和5)。

9.每个转化反应要在30°C下孵育30min。

10.把管转移到42°C水浴中热休克15min。

11.每个转化管加入600ul SOS。

12.将合适体积(100ul) 的转化细胞悬液移至SD- Trp- Leu培养板中，在28°C培养直到看见小而清晰的菌落为止(大约3天)。

3.3检测转化体的相互作用缺失情况

X - gal滤膜法通过测定β -半乳糖苷酶活性来反映蛋白质相互作用的情况。两个融合蛋白(一般分别称之为“诱饵”和“猎物”)相互作用，因此激活lacZ基因的转录产生β -半乳糖苷酶，催化X-gal水解生成蓝色产物。培养的时间和滤膜上检测到的蓝色产物颜色的深浅都可以用来和原来的质粒作比较，从而初步判断是否发生相互作用缺失的突变。

1.每个培养板上放-块硝化纤维滤膜，30秒，直至润湿，使菌落粘贴到滤膜上。

2.把滤膜放人液氮中，20秒后轻轻取出。冷冻时滤膜易碎，需小心处理。

3.把液氮冷冻的滤膜转移到100mm培养板的盖上，有酵母菌的一面朝上，100mm培养皿里放置了浸有含X- gal的Z缓冲液(1.5ml的Z buffer与15μl 100mg/ml的X-gal混合，使X-gal终浓度为1mg/ml)的Whatman滤纸。

4.盖上盖子防止脱水，在30°C培养滤膜。在不同时间点比较对照盘与共转化盘中菌落的蓝色程度。“诱饵”和“猎物”结合的时间各有不同。巨大的变化(白色菌落)常常是由于过早停滞密码子造成的，但也能够产生结合时发生极大差异的突变体。可以在一开始选择活性发生 了较小、中等及较大区 别的差异。

5.实验组培养板中的菌落，跟(原来的)阳性对照组相比，蓝色变浅，或者保持白色，挑出来画线到SD- Trp- Leu培养皿中来选择两种质粒的残留。用组氨酸缺陷培养基重新筛选出菌落。我们发现这个方法比X- gal筛选更灵敏。

3.4相互作用缺失突变质粒的恢复和再检测

利用修正的标准玻璃珠法[18]在酵母中提取质粒，也称作“smashandgrab"的制备过程。修正的部分也就是用商业化的质粒纯化柱去除能抑制转化的杂质。商业化的质粒纯化柱不一定要使用，实际中也不是每个实验室都使用了，但是我们发现它能够提高成功率，有时候特别显著。

1.将β-半乳糖苷酶活性减弱的菌落画线于含有SD- Leu放线菌酮的平板上，以筛选出[Q71L] ARF3- BD表达缺失的质粒。这一步不是必需的，但通常会加快从含有两种不同质粒的菌株中筛选出我们所要的质粒(AD- LTA1突变体) (见注释6)。

2.28°C培养≥3 天。

3.从SD-Leu环已酰亚胺培养基中接种菌落至20ml SD-Leu培养基，分别培养至OD₆₀₀约为1。

4.1000g 离心10分钟，收集细胞

5.用1ml的STES缓冲液清洗小球，然后再收集。

6.重悬于100ul的STES缓冲液，加入等体积的玻璃珠(见注解7)。

7.每管旋涡震荡2分钟。

8.加人100pl的STES和200pl的酚/氯仿旋涡震荡5~30分钟。时间因振荡器而异。

9.沉淀细胞和碎片，使之分层，以最大转速(约14 000g)离心:10分钟，转移上清到新管中。

10.用200ul酚/氯仿萃取，然后单独用氯仿。

11.根据厂商说明书，利用商业化的质粒提取试剂盒进一步纯化液相中的质粒。然后利用其产物去转化感受态细菌(如DH5a)。

12.使用任一种商业化的质粒提取试剂盒，从转化的DH5a中提取质粒。用限制性酶切分析来验证所得质粒的正确性。

13.将纯化的质粒转化到YAB457中，利用X - gal滤膜法检测转化体与[Q71L] ARF3 的相互作用。将其不同时间(15、30、60、180分钟)的颜色与YAB457表达的野生型LTA1作比较。通过目测划分为三个等级(三个加号)， 最高等级(三个加号)等同于野生型LTA1 (见注释8)。

3.5研究无相互作用蛋白质的特点

相互作用的缺失是诸多因素的结果，只有一些因素是关键氨基酸残基的点突变引起的。两种不太令人感兴趣的变化一过早停止编码突变和低水平的蛋白表达通过使细胞裂解液和HA抗体免疫杂交来确定标签在LTA1-AD融合蛋白的存在与否和相对丰度。将每个表达突变体LTA1的品系的蛋白表达水平与野生型的LTA1作比较(见注释9)。利用修正的Horvath和Riezman方法提取酵母细胞裂解液中的蛋白质。

1.每个酵母品系在选择性液体培养基中生长5个OD。

2.1000g, 离心5分钟，收集细胞。

3.用水清洗细胞，然后1000g,离心5分钟，收集细胞。

4.每一份沉淀重悬于20μl的1XSDS样品缓冲液中，95°C煮沸5分钟。

5.加入一个细胞体积的用酸洗过的玻璃小球，以最大速度旋涡震荡3分钟。

6.加入120ul样品缓冲液，煮沸5分钟。

7.用台式离心机最大转速离心15分钟，完全沉淀细胞裂解液。将上清转移至新离心管中煮沸5分钟。

8.加入7.5μl样品到含12% SDS的凝胶中，用标准方法再溶解蛋白。

9.将溶解的蛋白转移到硝酸纤维素上，60V, 2小时，用标准方法与12CA5 (HA)抗体免疫印迹。

如果突变体蛋白质文库转染进了ARF3 表达株中，则免疫印迹中会出现两条带，大小与AD- LTA1和ARF3 - BD融合蛋白相对应。Y190 -来源株也表达一个大约50kD的能与12CA5抗体结合的蛋白，所以用Y190来作对照组是一个不错的想法，至少在开始的时候是如此。若条带变小，或者免疫反应不发生(或显著降低)，则分别提示编码提前结束或者表达水平的变化。编码全长LTA1突变体的质粒同野生型LTA1几乎在同一水平表达，然后用pACT2测序引物# 1259和# 1260测序，检测是否发生了什么变化。

注释

1.这里讲的双杂交系统是Elledge实验室提出的，使用的是基于Gal4的报告系统。Y190 源于酿酒酵母，构建表达His3和lacZ报告基因，针对Gal4反式作用因子。它能够通过两个分别涉及Gal4两个不同结构域的Gal4杂交蛋白来检测蛋白质相互作用:一个蛋白质和Gal4的激活结构域结合，形成Gal4 - AD融合蛋白;另一个蛋白质同Gal4的DNA结合结构域融合，形成Gal4- BD融合蛋白。在Y190中表达时，如果两个融合蛋白没有发生相互作用，则酵母不能启动Gal4的启动子的转录，也就不能激活两个报告基因的转录。如果两个蛋白发生相互作用，那么就相当于形成了有功能的转录因子。因此，可以通过选取并分析组氨酸耐受型及β -半乳糖苷酶活性来判断蛋白之间的相互作用。

其他双杂交系统中，有些使用了其他基于Gal4的质粒，有些使用了两个以上的报告基因，有些使用了其他的转录激活因子(如LexA;可参考关于这部分的其他章节;见参考文献)。本章描述的步骤，仅需稍微调整，就可以用于其他双杂交系统，以进行反式双杂交筛选。

2. Taq聚合酶校正缺失的特点提高了突变的几率，而且大部分是A-T和A-G突变。可以使用其他的DNA聚合酶(如Stratagene的突变酶)来增加突变的多样性。

3.从pX]12 (与空的pACT2相反)制备线状载体，以确保在线状载体的分离中出现的完整质粒能够编码能否保留与[Q71L]ARF3的相互作用，并在X - gal滤膜实验中保持蓝色。

4.用未酶切的pXJ12转化YAB457,来确定转化效率。我们估计，在共转化反应中，加入等摩尔数的线状载体和PCR产物时，线状载体恢复效率(恢复后转化的效率)是完整质粒的一半。

5.最多可以作四个对照的转化反应，包括:①转化完整的pXJ12质粒，来确定总转化效率;②没有转化DNA;③单独转化有缺口的质粒;④单独转化PCR产物，以对共转化实验的培养皿上将会出现的背景水平作出估计。尽管不要求，但如果您的实验室是第-一次采用反向双杂交技术，最好还是作以上这些对照。

6. pAS1 - CYH和pBG4D都含有CyhS基因，可导致其对放线菌酮的敏感。在含有放线菌酮的培养基中培养含pACT2和pBG4D的质粒的细胞，选出不表达pBG4D质粒的细胞，这样就可以更容易地分离出pACT2一LTA1质粒。

7.这一步和下一步是最为关键的步骤，也最容易导致质粒回收率低。珠子和细胞太少就会在离心管中旋转，太多就会聚集成团而影响剪切力，使细胞不易溶解。

8.除了X- gal滤膜实验法，还可以用液体培养基β -半乳糖苷酶活性分析更准确地测量其活性。简而言之，将酵母的复制品系在5ml选择培养基中30°C培养过夜。次日，取过夜培养物20~50ul,加入5ml新鲜的选择培养基，生长到中间对数期(OD00=0.3~0.7)。离心收集细胞，并重悬于1ml的Zbuffer,置于冰上。酵母菌(50~ 100ul)同Z buffer混合到体积为1ml,用巴斯德滴管加入一滴0.1% SDS和两滴氯仿。将混合物旋涡震荡15分钟，并在30℃培养15分钟。加入O-nitrophenol -a- D- galactopyranoside (ONPG, 0. 8mg)，震荡5秒，在30°C培养，直到阳性对照组变成中等黄色。加入0. 5ml 1mol/L的Na2CO3中止反应，并记录时间。离心去除细胞碎片后，测量OD420和ODs00的值。活力单位的值由下面的公式得出:

U= 1000(OD₄₂₀ -OD₅₀₀)/(T X V X OD₆₀₀)

其中V是分析中用到的培养基的体积(μl)， T是反应的时间(分钟)，OD₆₀₀是分析开始时细胞的密度，OD₄₂₀代表了ONPG吸收和细胞碎片发生的光线散射的总和，OD₅₀₀代表了细胞碎片发生的光线散射。

9.除了提供Gal4激活结构域，pACT2也在Gal4-AD之后、目的蛋白之前加入了HA标签。其他编码Gal4 DNA结合结构域的质粒，如pBG4D或pAS1 - CYH,在其融合蛋白产物中也含有HA标签，因此加入HA抗体做印迹时也会表现出来。当利用免疫印迹比较蛋白表达水平时，必须分析每个样品的蛋白浓度并在胶中加入等量的蛋白，因为在细胞裂解和蛋白质复性过程中会出现一些误差。需要注意的是，酵母菌所表达的蛋白质并不一定能达到足以做免疫印迹的水平，但是仍然可以用双杂交和反式双杂交方法检测出来。

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