酵母双杂交系统

酵母双杂交系统(yeast two-hybrid system)是一种直接于酵母细胞内检测蛋白质-蛋白质相互作用而且灵敏度很高的分子生物学方法。该系统在1989年有Fields和Song等在研究真核基因转录调控中首次建立并得到广泛的应用。此项技术的出现使以往因耗时、繁琐的物理测定和基因筛选限制而无法实现的许多设想，都可能逐一实现，酵母双杂交系统是鉴定及分析蛋白质-蛋白质间相互作用的最常用及最有效的工具之一，此技术现已逐渐推广到了如信号传导、细胞周期调控及基因表达调控等多个领域。

(一)酵母双杂交系统原理

真核生物中有种特殊的上游激活序列(upstream activating sequence,UAS).可以在转录水平上进行基因表达的调控，它的作用就是与激活蛋白结合从而大大增加启动子的转录速度。酵母双杂交系统是建立在人们对酵母转录因子GAL4蛋白的认识基础上。酵母中存在着转录因子GAL4蛋白，该蛋白能激活转录主要是因为它有两个结构上可以分开的、功能上相互独立的结构域，即位于氨基(N)端的DNA结合结构域(DNA-Binding domain, DNA-BD)以及位于羧基(C)端的转录激活结构域(transcriptional activation domain,TAD)。这两个结构域在它们分开时仍分别具有功能，即DNA结合结构域仍具有结合DNA能力，但因缺少转录激话结构域而不能激话转录:而转录激活结构录虽然有激活转录功能，但因无法正确定位于DNA上也不能激活转录。即DNA-BD和AD单独分别作用并不能激活转录反应，只有将这两部分通过适当的途径连在一起后才恢复激活转录的活性，激话UAS下游启动子,使启动子下游基因得到转录。导致结合和激话发生的关键是DAN-BD和AD两个结构域通过共价或非共价连接建立的空间联系。

根据这一特性，可以构建两种重组质粒，分别表达GAL4蛋白N端的1-147个氨基酸(DNA-BD)和羧基端的768-881个氨基酸(AD)。若在DNA-BD上再接上一个“诱饵”蛋白X，在AD上接上一个“猎物”蛋白Y,再将这两个质粒共同转化至酵母体内。如果x、Y蛋白在酵母核内发生交互作用，则相当于将GAL4的DNA-BD和AD又连在一起，从而激活UAS下游启动子调节的报告基因的表达，使转化子由于报告基因的表达而可以在特定的缺陷培养基上生长，同时因激活转录下游GAL1-LacZ和/或MEL1基因的表达，从而在X-Gal存在下显蓝色。这样就可以利用报告基因的转录指示诱饵蛋白X与猎物蛋白Y之间是否反应。最后，将阳性克隆子在二缺平板上划线3次，提取酵母质粒，转化E.coli,提取质粒，进行PCR或双酶切去除含有相同长度cDNA的克隆子，并对插人片段测序，将获得的序列通NCBI数据库进行相似性搜索。

由于该系统将一个蛋白X与GAL4的DNA-BD杂交,再将第二个蛋白Y与GAL4的AD杂交，因此称该系统为双杂交系统。目前双杂交系统大多都应用于酵母中，故称为酵母双杂交系统。酵母是真核细胞，表达的蛋白质可以在细胞核中产生交互作用。而且酵母菌有很多肯养缺陷型标记，有利于对质粒的选择，筛选比较方便，如MELI、LacZ报告基因,通过颜色反应即可验证蛋白X与蛋白Y是否发生交互作用。所有的报告基因的启动子都经过了特殊改造,插人了所采用的DNA结合蛋白的特异结合序列，经改造的启动子和报告基因能稳定地整合到醉母细胞的基因组。酵母细胞本身并不能表达能激活报告基因的转录因子,报告基因的表达只依赖于体系中x、Y蛋白的同时存在和相互作用。由于酵母双杂交系统是通过利用两蛋白相互作用后，观察能否激活报告基因，而决定两蛋白间是否有相互作用的，因而在酵母体内表达的诱饵蛋自或猎物蛋白两者单独均不能激活报告基因的转录因子。

酵母双杂交系统特点与优点：

1.双杂交系统具有独特优势
①它实现了真正的克隆基因目标化。利用该系统不但可找到相互作用的蛋白质，而且能直接有效地克隆到这些蛋白质的基因。
②使用该系统分析蛋白质的反应时，是在细胞内进行并完成的，故而检测分析不受外界的限制。且反映了蛋白在体内的交互作用。
③该系统还可以高灵敏度地检测蛋白与蛋白之间的交互作用。利用其来检测两个蛋白之间是否存在交互作用，只要将编码两个蛋白质的DNA序列分别克隆到双杂交系统的载体中，即可通过检测报告基因是否表达从而论证这两个蛋白质是否发生交互作用。它之所以具付高度敏感性，主要是因为杂合蛋白是由高拷贝质粒的强启动子过量表达的蛋白，信号测定是在自然平横浓度条件下进行;
④酵母表型、X-Gal及HIS3等蛋白表达等检测方法均很敏感。双杂交系统是在真核模式生物酵母细胞内进行的，对蛋白质间微弱的及瞬间的作用也能够通过报告基因的表达产物检测得到，是一种具有高灵敏性的检测蛋白质间关系的技术。它不仅可以用于研究哺乳动物基因组编码的蛋白质之间的相互作用，还可以用来研究植物等基因组编码的蛋白质之间的相互作用。

酵母双杂交系统的局限性及优化

1．局限性　

如在双杂交过程中，要经过转化，但是酵母细胞的转化效率相当低，要比细菌低约4个数量级，转化步骤往往成为该技术的一个瓶颈。

由于双杂交过程是在细胞核内完成的。然而许多蛋白质的相互作用不仅局展于核内，因而对于研究膜蛋白、分泌蛋白、膜受体及胞质蛋白有很大的局限性。分离的泛素系统(split-ubiquitin system)是一种不依赖转录激活机制的酵母双杂交系统，更适合于发生在胞膜或脂质中的蛋白质相互作用研究。sos蛋白介导的双杂交系统(SOS recruitment system)也可用于分析膜受体及细胞外分泌蛋白相互作用。

2．假阳性

可以针对表达型载体进行改进，比如融合蛋白可以被置于一些可诱导的启动子调控之下，使蛋白质在酵母的表达量能依需要进行调控。其次，发展哺乳动物细胞双杂交系统可以较好地研究此类蛋白质间的相互作用。

此外，由酵母双杂交衔生出的单杂交系统(one-hybrid system)、三杂交系统(three-hybrid system)、反向双杂交系统(reverse two-hybrid system)等对传统的双杂交系统作出了重要补充和扩展。

酵母双杂交技术已经在蛋白质间的相互作用研究、筛选新的蛋白质、研究蛋白质的结构与功能等诸方面发挥着重要作用，随着酵母杂交体系技术的不断完善与提高,以及在应用方面经验的不断积累，基于酵母双杂交原理而建立的一系列方法将为生命科学的进展起到积极的推动作用。

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