酵母双杂交点对点验证实验步骤

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实验原理

    单倍体MATa型酵母Y2HGold与单倍体MATα型酵母Y187可杂交形成二倍体酵母,使其同时含有pGBKT7-Bait质粒与pGADT9-Prey质粒。当Bait与Prey互作时,可激活系统中Gal4下游报告基因ADE2、HIS3、AUR1-C、MEL1,使得酵母可在-Ade、-His营养缺陷型培养基及含AbA的培养基上生长,同时表达α-半乳糖苷酶,使X-α-Gal显色底物变蓝。

    实验对照组中,p53与T有互作,为阳性对照组;Lam与T无互作,为阴性对照组。

    每个pGBKT7-Bait[Y2H]单转化菌株要经过SD-Trp/-His/-Ade验证其是否存在自激活;再与pGADT7 [Y187]空载体杂交后在QDO上进一步验证其与DNA激活域是否存在直接互作。

    每个pGADT7-Prey[Y187]单转化菌株要经过SD-Leu/-His/-Ade验证其是否存在自激活;再与pGBKT7 [Y2H]空载体杂交后在QDO上进一步验证其与DNA结合域是否存在直接互作。

    在排除所有非验证蛋白互作可能后,互作验证方为有效。

实验方案
    1.构建诱饵蛋白到pGBKT7载体上,核对目的基因序列正确后转入Y2H菌株。
    2.构建受猎蛋白到pGADT7载体上,核对目的基因序列正确后转入Y187。
    3.通过检测诱饵蛋白在SD-Trp/-His/-Ade来检测Bait自激活情况。当存在轻微自激活时,改用全部报告基因检测条件,检测自激活情况。无自激活现象可继续实验;有自激活现象中止实验。
    4.通过检测诱饵蛋白在SD-Leu/-His/-Ade来检测Prey自激活情况。当存在轻微自激活时,改用全部报告基因检测条件,检测自激活情况。无自激活现象可继续实验;有自激活现象中止实验。
    5.通过检测pGBKT7-Bait[Y2H]与pGADT7 [Y187]杂交菌株在QDO培养基上的生长情况,判断诱饵蛋白是否存在于DNA激活域的直接互作。有互作中止实验,无直接互作可继续实验。
    6.通过检测pGADT7-Prey[Y187]与pGBKT7 [Y2H]杂交菌株在QDO培养基上的生长情况,判断诱饵蛋白是否存在于DNA结合域的直接互作。有互作中止实验,无直接互作可继续实验。
    7.根据订单要求,将pGBKT7-Bait[Y2H]与pGADT7-prey[Y187]杂交。
    8.涂布DDO获得杂交菌株。
    9.涂布QDO验证互作情况。
    10.涂布QDO/A进一步验证互作情况。
    11.通过筛选的互作菌株通过QDO/A/X最终确定互作情况。
    12.实验结束。

实验流程

酵母双杂交点对点验证试验流程

实验材料

    1.酵母菌株:Y2HGold、Y187
    2.质粒:

空载体 对照质粒 Bait质粒 Prey质粒
pGBKT7
pGADT7
pGBKT7-p53
pGBKT7-Lam
pGADT7-T
pGBKT7-396
pGBKT7-931
pGADT7-396
pGADT7-931
    3.核蛋白酵母双杂交系统(Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System)
    4.培养基:
    1).酵母完全培养基:YPDA:1% Yeast extract,2% Tryptone,2% Glucose, 0.02% Adenine。
    2). 酵母营养缺陷型筛选培养基:参照Clontech公司的Matchmaker Gold Yeast Two-Hybrid System。其中各种培养基分别以下列符号表示:
    DDO:SD-Trp/ -Leu;
    QDO:SD-Trp/ -Leu/-His/ -Ade。
    QDO /A:QDO+AbA
    QDO/X/A:QDO+AbA+X-α-Gal

 

实验方法

    1.酵母转化

    将下述质粒转入对应受体菌中,获得单转化菌株。

Strain Plasmid Medium 备注
1 Y2HGold pGBKT7-p53 SD/-Trp with agar 阳性对照
2 Y2HGold pGBKT7-Lam SD/-Trp with agar 阴性对照
3 Y187 pGADT7-T SD/-Leu with agar 对照
4 Y2HGold pGBKT7 SD/-Trp with agar 空对照
5 Y187 pGBKT7 SD/-Leu with agar 空对照
6 Y2HGold pGBKT7-396 SD/-Trp with agar 实验组
7 Y2HGold pGBKT7-931 SD/-Trp with agar 实验组
8 Y187 pGBKT7-396 SD/-Leu with agar 实验组
9 Y187 pGBKT7-931 SD/-Leu with agar 实验组


    酵母单转化方法

    1)准备4℃保存一个月内的酵母平板培养菌株
    2)用300μL无菌水洗1个单克隆,置于1.5mL离心管内。1000g离心5min,除去上清,尽量吸除干净。
    3)加入100ng质粒 DNA 和变性鲑鱼精 DNA 5 μL。加入钟鼎自制快速酵母转化液(钟鼎生物)300μL,震荡混匀。
    4)45℃孵育70min
    5)1000g离心5min,除去上清,尽量吸除干净。用1mL 的 0.9%NaCl重悬
    6)重悬后的酵母吸取10μL的菌液,涂布于对应的筛选培养基上。
    7)30℃培养 3~5d,待菌斑长出。
    8)将菌斑用含25%甘油的冻存液重悬保存。

    2.自激活检测检测结果

    单转化菌株自激活检测实验方案及结果如下表

BD实验组 AD实验组
BD Strain pGBKT7-396 [Y2HGold]
pGBKT7-931 [Y2HGold]
pGADT7-396 [Y187]
pGADT7-931[Y187]
Medium SD-Trp/ -His/ -Ade with agar SD-Leu/ -His/ -Ade with agar
实验结论 BD实验组无自激活 AD实验组无自激活
实验结果 酵母双杂交点对点验证 酵母双杂交点对点验证


    3.杂交验证实验方案及结果如下表

BD Strain AD Strain Medium
阳性对照 pGBKT7-p53[Y2HGold] pGADT7-T[Y187] DDO
阴性对照 pGBKT7-Lam[Y2HGold] pGADT7-T[Y187] DDO
空激活对照组1 pGBKT7-396 [Y2HGold] pGADT7[Y187] DDO
空激活对照组2 pGBKT7-931 [Y2HGold] pGADT7[Y187] DDO
空激活对照组3 pGBKT7[Y2HGold] pGADT7-396 [Y187] DDO
空激活对照组4 pGBKT7 [Y2HGold] pGADT7-931 [Y187] DDO
实验组1 pGBKT7-396 [Y2HGold] pGADT7-931 [Y187] DDO
实验组2 pGBKT7-931 [Y2HGold] pGADT7-396 [Y187] DDO


    酵母单杂交方法

    1.根据实验要求准备好对应的实验用菌株
    2.杂交一组,挑取2~3mm的菌斑,将两个菌斑挑到同一个含1mL 2*YPDA的 2mL离心管中。200rpm,30℃培养过夜(20~24h)
    3.杂交后离心去除培养基,用1mL 0.9%NaCl重悬
    4.吸取10μL涂布至DDO培养基
    5.30℃培养3d

酵母双杂交点对点验证

    杂交菌株在DDO平板上的生长情况




    酵母互作验证方法

    1.根据实验要求准备好对应的实验用菌株
    2.挑取一个单克隆菌落,用200μL的无菌水重悬
    3.吸取10μL滴加在对应的验证平板上,30℃培养3d
    4.在需要X-α-Gal显色验证的菌苔上滴加5μL的X-α-Gal工作液,30℃培养30min后观察显色情况。

酵母双杂交点对点验证

    QDO/A培养基上验证互作菌株



酵母双杂交点对点验证

    DDO/X培养基验证互作菌株

实验结论

    396与931在核体系酵母双杂互作验证中,正反杂交均未见互作现象。

返还运输条件:干冰运输。





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