酵母双杂交点对点验证实验步骤

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1、诱饵验证

为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响,需要对客户提供的原始克隆pGBKT7-GRX进行测序和比对分析。

1.1诱饵验证结果

诱饵克隆pGBKT7-GRX序列正确,可继续进行后续实验。

2、自激活和毒性检测及互作验证

2.1酵母转化方法

(1) 将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线,30°C 培养箱倒置培养 3 天左右,直到克隆大小为 2 - 3 mm

(2) 挑取一个酵母克隆于 3 mL 的 YPDA 培养基中(15 mL 灭菌的离心管);在 30°C 摇床振荡培养 8 h;

(3) 吸取 5 μL 至 50 mL YPDA 中(250 mL三角瓶),在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 16 - 20 h,直至 OD600 = 0.15 - 0.3;

(4) 室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体;

(5) 倒去上清并用 100 mL YPDA 重悬酵母;在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3 – 5 h,至 OD600 = 0.4 - 0.5;

(6) 室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 60 mL 无菌去离子水重悬酵母;

(7) 室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体,倒去上清并用 3 mL 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬酵母;

(8) 将重悬液分装为 3 个 1.5 mL 的离心管;高速离心 15 s;

(9) 倒去上清并将酵母重悬于 600 μL 1.1 x TE/LiAc 溶液;

(10) 按照下表构建反应:

Reaction Bait plasmid Prey plasmid 涂板种类 备注
1 pGBKT7-p53 pGADT7-T DDO/TDO/QDO 阳性对照
2 pGBKT7-lam pGADT7-T DDO/TDO/QDO 阴性对照
3 pGBKT7-GRX pGADT7 DDO/TDO/QDO 自激活检测
4 pGBKT7-GRX ———— SD/Trp 毒性检测
5 pGBKT7-GRX pGADT7-MYB DDO/TDO/QDO 互作验证
6 pGBKT7-GRX pGADT7-SKIP DDO/TDO/QDO 互作验证
7 pGBKT7-GRX pGADT7-NAC DDO/TDO/QDO 互作验证
8 pGBKT7-GRX pGADT7-Drought DDO/TDO/QDO 互作验证
9 pGBKT7-GRX pGADT7-Bzip75 DDO/TDO/QDO 互作验证
10 pGBKT7-GRX pGADT7-Bzip68 DDO/TDO/QDO 互作验证
11 pGBKT7-GRX pGADT7-PC DDO/TDO/QDO 互作验证

(11) 每管反应中加入 5 μL 预变性的 Carrier DNA、300 μL 1 x PEG/LiAc 溶液,混匀;

(12) 每管反应中加入 50 μL 重悬酵母感受态细胞,缓慢混匀;

(13) 30°C 水浴 30 min,每 10 min 混匀一次;

(14) 每管加入 20 μL DMSO,混匀;

(15) 42°C 水浴热激 15 min,每 5 min 上下颠倒混匀一次;

(16) 700 g 离心 5 min;

(17) 弃掉上清,用 0.2 mL YPD Plus 液体培养基重新悬浮;注:YPD Plus 是特别配制的增强转化;这个步骤不使用 YPD 培养基。

(18) 30°C 摇床振荡复苏培养,合适时间(1 h);

(19) 高速离心 15 s;

(20) 弃掉上清,用 100 μL 0.9% NaCl 溶液重新悬浮细胞。取 10 μL 重悬液,稀释 100 x 涂平板。

2.2诱饵自激活验证与毒性检测结

(1)阳性对照

阳性对照图

图1阳性对照

(2)阴性对照

阴性对照图

图2阴性对照

(3)自激活检测结果

自激活检测结果图

图3自激活检测结果

(4)毒性检测

毒性检测图

图4 SD/-Trp

2.2.1毒性检测与自激活检测结果分析

(1)将诱饵质粒和猎物空载共转化Y2H Gold感受态,涂布DDO平板能生长说明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性;

(2)涂布TDO有轻微生长,说明诱饵蛋白有轻微自激活;

(3)涂布QDO不能生长,说明诱饵不能激活ADE2的表达,可用 QDOXA进行后续实验;

(4)质粒pGBKT7-GRX转入Y2HGold后,菌落生长情况同pGBKT7空载转化酵母后的一致,表明pGBKT7-GRX质粒对酵母细胞均无毒性。

2.3互作验证结果

互作验证结果图
互作验证结果图

图5互作验证结果

2.3.1互作验证结果分析:

(1)将诱饵质粒和猎物质粒共转化Y2H Gold感受态,涂布DDO平板能生长说 明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性;

(2)涂布TDO和QDO均能生长,说明诱饵蛋白和猎物蛋白能激活HIS3、ADE2的表达,所以诱饵蛋白和猎物蛋白有相互作用。

3、点板验证

挑取验证平板上面的单克隆稀释点板至DDO和QDOXA,点板结果如下:

点板结果图

图6点板验证图片

3.1互作验证结果分析:

(1)点板验证结果与前面验证一致,所有点板组合在DDO上生长正常,阳性对照在QDOXA生长且变蓝,说明阳性对照正常。阴性对照在QDOXA不生长,说明阴性对照正常。

(2)实验组pGBKT7-GRX+pGADT7-MYB、pGADT7-SKIP、pGADT7-NAC、pGADT7-Drought、pGADT7-Bzip75、pGADT7-Bzip68、pGADT7-PC在QDOXA上生长,说明能够激活下游报告基因。

综上所述:诱饵蛋白pGBKT7-GRX与猎物pGADT7-BAM3pGADT7-MYB、pGADT7-SKIP、pGADT7-NAC、pGADT7-Drought、pGADT7-Bzip75、pGADT7-Bzip68、pGADT7-PC之间有相互作用。




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