1、诱饵验证

为避免因序列差异造成对后期实验结果的影响，需要对客户提供的原始克隆pGBKT7-GRX进行测序和比对分析。

1.1诱饵验证结果

诱饵克隆pGBKT7-GRX序列正确，可继续进行后续实验。

2、自激活和毒性检测及互作验证

2.1酵母转化方法

（1） 将 Y2H Gold 酵母菌种在 YPDA 平板上划线，30°C 培养箱倒置培养 3 天左右，直到克隆大小为 2 - 3 mm

（2） 挑取一个酵母克隆于 3 mL 的 YPDA 培养基中（15 mL 灭菌的离心管）；在 30°C 摇床振荡培养 8 h；

（3） 吸取 5 μL 至 50 mL YPDA 中（250 mL三角瓶），在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 16 - 20 h，直至 OD600 = 0.15 - 0.3；

（4） 室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体；

（5） 倒去上清并用 100 mL YPDA 重悬酵母；在 30°C 摇床 230 - 250 rpm 振荡培养 3 – 5 h，至 OD600 = 0.4 - 0.5；

（6） 室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 60 mL 无菌去离子水重悬酵母；

（7） 室温 700 g 离心 5 min 以收集菌体，倒去上清并用 3 mL 1.1 x TE/LiAc 溶液重悬酵母；

（8） 将重悬液分装为 3 个 1.5 mL 的离心管；高速离心 15 s；

（9） 倒去上清并将酵母重悬于 600 μL 1.1 x TE/LiAc 溶液；

（10） 按照下表构建反应：

Reaction	Bait plasmid	Prey plasmid	涂板种类	备注
1	pGBKT7-p53	pGADT7-T	DDO/TDO/QDO	阳性对照
2	pGBKT7-lam	pGADT7-T	DDO/TDO/QDO	阴性对照
3	pGBKT7-GRX	pGADT7	DDO/TDO/QDO	自激活检测
4	pGBKT7-GRX	————	SD/Trp	毒性检测
5	pGBKT7-GRX	pGADT7-MYB	DDO/TDO/QDO	互作验证
6	pGBKT7-GRX	pGADT7-SKIP	DDO/TDO/QDO	互作验证
7	pGBKT7-GRX	pGADT7-NAC	DDO/TDO/QDO	互作验证
8	pGBKT7-GRX	pGADT7-Drought	DDO/TDO/QDO	互作验证
9	pGBKT7-GRX	pGADT7-Bzip75	DDO/TDO/QDO	互作验证
10	pGBKT7-GRX	pGADT7-Bzip68	DDO/TDO/QDO	互作验证
11	pGBKT7-GRX	pGADT7-PC	DDO/TDO/QDO	互作验证

（11） 每管反应中加入 5 μL 预变性的 Carrier DNA、300 μL 1 x PEG/LiAc 溶液，混匀；

（12） 每管反应中加入 50 μL 重悬酵母感受态细胞，缓慢混匀；

（13） 30°C 水浴 30 min，每 10 min 混匀一次；

（14） 每管加入 20 μL DMSO，混匀；

（15） 42°C 水浴热激 15 min，每 5 min 上下颠倒混匀一次；

（16） 700 g 离心 5 min；

（17） 弃掉上清，用 0.2 mL YPD Plus 液体培养基重新悬浮；注：YPD Plus 是特别配制的增强转化；这个步骤不使用 YPD 培养基。

（18） 30°C 摇床振荡复苏培养，合适时间（1 h）；

（19） 高速离心 15 s；

（20） 弃掉上清，用 100 μL 0.9% NaCl 溶液重新悬浮细胞。取 10 μL 重悬液，稀释 100 x 涂平板。

2.2诱饵自激活验证与毒性检测结

（1）阳性对照

图1阳性对照

（2）阴性对照

图2阴性对照

（3）自激活检测结果

图3自激活检测结果

（4）毒性检测

图4 SD/-Trp

2.2.1毒性检测与自激活检测结果分析

（1）将诱饵质粒和猎物空载共转化Y2H Gold感受态，涂布DDO平板能生长说明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性；

（2）涂布TDO有轻微生长，说明诱饵蛋白有轻微自激活；

（3）涂布QDO不能生长，说明诱饵不能激活ADE2的表达，可用 QDOXA进行后续实验；

（4）质粒pGBKT7-GRX转入Y2HGold后，菌落生长情况同pGBKT7空载转化酵母后的一致，表明pGBKT7-GRX质粒对酵母细胞均无毒性。

2.3互作验证结果

图5互作验证结果

2.3.1互作验证结果分析：

（1）将诱饵质粒和猎物质粒共转化Y2H Gold感受态，涂布DDO平板能生长说 明重组诱饵质粒成功转入宿主菌且对宿主菌无毒性；

（2）涂布TDO和QDO均能生长，说明诱饵蛋白和猎物蛋白能激活HIS3、ADE2的表达，所以诱饵蛋白和猎物蛋白有相互作用。

3、点板验证

挑取验证平板上面的单克隆稀释点板至DDO和QDOXA，点板结果如下：

图6点板验证图片

3.1互作验证结果分析：

（1）点板验证结果与前面验证一致，所有点板组合在DDO上生长正常，阳性对照在QDOXA生长且变蓝，说明阳性对照正常。阴性对照在QDOXA不生长，说明阴性对照正常。

（2）实验组pGBKT7-GRX+pGADT7-MYB、pGADT7-SKIP、pGADT7-NAC、pGADT7-Drought、pGADT7-Bzip75、pGADT7-Bzip68、pGADT7-PC在QDOXA上生长，说明能够激活下游报告基因。

综上所述：诱饵蛋白pGBKT7-GRX与猎物pGADT7-BAM3pGADT7-MYB、pGADT7-SKIP、pGADT7-NAC、pGADT7-Drought、pGADT7-Bzip75、pGADT7-Bzip68、pGADT7-PC之间有相互作用。

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