膜蛋白酵母双杂交总结-分离的泛素系统

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一、概述

蛋白质-蛋白质相互作用几乎涉及所有生物学过程,从细胞内大分子结构和酶复合体的形成到信号传导道路的调节。据统计,真核细胞内大约有1/3 的蛋白质都与膜有关。由于它们内在的疏水性,故采用传统的酵母双杂交系统对它们进行研究就比较困难。这里我们介绍一个新的遗传学方法,可用于检测正在增殖的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)胞内膜蛋白的相互作用。该系统基于体内检测分裂泛素进行重组的过程。当X和Y蛋白发生相互作用时,会发生泛素重组并导致蛋白酶体清除,而后能够激活用于检测的报告系统的转录因子释放。通过这种方式,与传统用于检测核内相互作用蛋白的酵母双杂交系统相比,这种用于膜蛋白研究的酵母双杂交系统是-种体内检测系统,可检测膜蛋白在其自然环境中发生的相互作用。

1.1、用于膜蛋白研究的酵母双杂交系统检测蛋白质蛋白质相互作用

这种分裂泛素系统(split-ubiquitin system)是检测细胞内蛋白质相互作用的一种研究方法。它创建于1994年,用于检测可溶性蛋白质之间的相互作用。后来发展了3项技术使其能检测膜蛋白的相互作用,并可作为一种筛选系统,见图1。

用于膜蛋白研究的酵母双杂交分析系统

图1 用于膜蛋白研究的酵母双杂交分析系统。

(A) X和Y的相互作用可以导致一种分裂-泛素异二聚体的形成,这种异二聚体可以被UBP识别并剪切,从而释放TF,它随后转位人核并结合到位于lacZ和HIS3报告基因上的LexA结合位点,从而分别导致β-半乳糖苷酶激活以及组氨酸合成。带有发生相互作用的X和Y的酵母菌能被识别出来,主要是因为它们在X- gal存在下表现为蓝色,并能在缺乏组氨酸的琼脂平板上生长。

(B) 假若X和Y不发生相互作用,这种分裂泛素异二聚体将不会被重组,从而也不会剪切出TF以及激活报告基因。


与双杂交系统相似,在两个待测蛋白质的相互作用下,转录因子可再次被组装,分裂泛素系统是由泛素的两个片段组成,借助能发生相互作用的蛋白质的作用,这两个片段便又可组合在一起。泛素是由76个氨基酸残基组成的一个小蛋白质,它主要参与蛋白质降解的许多细胞内通路。特别是泛素的C-末端能通过一个酰胺基同各种蛋白质连接,使得它们在由数种酶组成的复合体作用下得以降解。泛素特异性蛋白酶(ubiquitin- specific protease,UBP)可以识别与蛋白质融合的那部分泛素,并且剪切开泛素与蛋白之间的共价链,从而使得蛋白质在蛋白酶体的作用下发生降解。

为了使用分裂泛素系统来检测相互作用,泛素被分成了两个部分,用两个独立的质粒分别来表达,一个是泛素的N -端片段(1~37位氨基酸残基,NubI), 另个便是Cub的C-端(35~76位氨基酸残基,Cub)。 报告蛋白被设计与CubC-端相连,当它与NubI共表达时,这种分裂的泛素片段便会发生重新组装,形成一个分裂泛素异二聚体,从而导致报告蛋白的释放。这是由于分裂-泛素是UBP作用的底物,它可使报告蛋白从Cub的C-端剪切下来,从而让报告蛋白得以人核并激活报告基因。在分裂泛素系统,NubI片段的N-端被做了位点突变修饰(NubG), 从而使它不能自发同Cub相连。只有当两个融合蛋白经相互作用发生相连时,NubG和Cub报告蛋白才会发生组装。

因为这种分裂-泛素复合体的形成不需要对蛋白特异性定位,因此,这个系统后经改良可用于检测膜蛋白的相互作用。在这种用于膜蛋白研究的分裂-泛素系统中,一个感兴趣蛋白质作为诱饵被融合到带有人工转录因子的Cub结构域上,而其他的作为“猎物Y”被融合到NubG。为了检测两种蛋白X和Y潜在的可能的相互作用,给酵母报告菌L40转染了这两个质粒。两种蛋白的相互作用可导致分裂泛素异二聚体的组装并在蛋白酶解作用下释放转录因子,继而转位人核,从而引起两种报告基因lacZ和HIS3的激活。因此,这种相互作用可直接通过将酵母菌接种在缺乏组氨酸的选择性培养基上生长,再进行X- gal检测β -半乳糖苷酶的表达来确定(见图1)。

在这里,我们阐述了膜蛋白与可溶性蛋白质或者是两种膜蛋白之间相互作用的在体检测方法。

一个跨膜诱饵蛋白X被融合到一个紧跟Cub结构城相连的人工转录因子之后,从而形成-种蛋白质X - Cub- TF嵌合体。“猎物Y”可以是胞浆蛋白,也可以是膜蛋白,被融合到Nub结构城。


二、材料

材料
1. L40酵母报告菌株: MATa trp-1 leu2 HIS3 LYS2 : : lexA- HIS3 URA3 : : lexA- lacZ。 2.“诱饵”表达质粒,pX-Cub- TF或pTF- Cub- X:以 Cub-TF融合蛋白的形式来表达诱饵蛋白。这个质粒带有 LEU2的选择性标记以及氨苄青霉素抗性基因。
3.“猎物”表达质粒,pY- HA- NubG或pNubG - HA - Y: 以NubG融合蛋白的形式来表达猎物蛋白。质粒带有TRP1 选择性标记和一个氨苄青霉素抗性基因。 4. YPD培养基: 1% Bacto -酵母提取物,2% Bacto -蛋白胨, 2%葡萄糖,2% Bacto -琼脂。
5.不含有亮氨酸、色氨酸或组氨酸的缺陷成分培养基(Clontech)。 6.合成缺陷培养基: 0. 67% Bacto -酵母氮源(无氨基酸),2% 葡萄糖,2% Bacto琼脂, 0.1% 省缺成分混合物。 SD-Trp 培养基又额外补充了100mg/L的亮氨酸和20mg/L组氨酸。 而SD- Trp- Leu培养基补充了20mg/L的组氨酸。
7. PEG (聚乙二醇) 4000 (50%w/v)。 8.1mol/L LiOAc。
9.10mg/ml 单链载体DNA (Clontech) 。 10.500um的玻璃珠(Sigma)。
11.裂解缓冲液: 100mmol/L Tris- HCl, pH 7.5, 200mmol/L NaCl, 20%甘油,5mmol/L EDTA pH 8. 0,1mmol/L PMSF, 14nmol/L β-硫基乙醇,0. 5mmol/L亮肽素,0. 25mmol/L 胃酶抑素以及0. 5mmol/L抑氨肽酶素,4C保存。 12.微量离心管。
13.旋转轮(rolling wheel)。 14.摇床(rocker plaform)。
15.振荡器(shaker),30°C。 16.加热块(heat block), 42°C。
17. SDS- PAGE装置。 18.电转染装置。
19. SDS 样品缓冲液: 0. 0625mol/L Tris- HCI, pH 6.8,2% SDS, 5% β-硫基乙醇,10%甘油,8mol/L 脲嘧啶, 0.025%溴酚蓝。 20.电转缓冲液: 25mmol/L Tris- HCl, pH 8. 3, 192mmol/L 甘油,20% (v/v) 甲醇,4C保存。
21.漂洗缓冲液: 10mmol/L Tris- HCI, pH 7. 5, 150mmol/L NaCl, 0. 05% (w/v) Tween 20。 22.封闭液: 5% (w/v) 脱脂奶粉,用漂洗缓冲液溶解。
23.免VP16多克隆抗体(Clontech) 。 24.小鼠HA多克隆抗体(BabCO)。
25.偶联辣根过氧化物酶的二抗。 26.增强型化学发光液(Pierce) 。
27. X胶片。 28.: 3MM Whatman滤纸,已消毒。
29. X- gal 10mg/ml现溶于N, N- 2 -甲基酰胺。 30. TBS缓冲液: 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.3% Tris 碱 pH 7.4。
31. X-gal缓冲液:用1XTBS溶解0.5%琼脂糖,在培养基冷却 到50°C后,于每升1XTBS中加人1ml X- gal。 32.琼脂。
33.氨苄青霉素。 34.限制性内切酶,T4 DNA连接酶。

三、方法

以下分别描述①在酵母内进行全长的异源性膜蛋白表达,②重建已知蛋白质与蛋白质相互作用,③使用这种用于膜蛋白研究的酵母双杂交系统进行文库筛选,从中获得新的相互作用搭档(见图2)。

用于膜蛋白研究的酵母双杂交实验操作流程图

图2 用于膜蛋白研究的酵母双杂交实验操作流程图。

3.1在酵母内进行异源性蛋白的表达

3.1.1克隆

这一节主要讲述如何将目的cDNA插人到“诱饵”和“猎物”载体,转化酵母以表达出这些融合蛋白,并检测它们的报告基因活化情况。

3.1.1.1 pX -Cub- TF/pTF- Cub- X诱饵载体

诱饵载体pX- Cub- TF和pTF- Cub - X都是着丝粒的载体,它们带有一-个复制的ARSH4起点以及CEN6基因座,从而允许以低拷贝存在(每个细胞1~2个质粒)。它包括一个弱细胞色素C氧化酶(eytochrome c oxidase, CYC1)启动子,这就使得这种融合体以低水平表达(注:诱饵载体pX- Cub- TF/pTF- Cub- X需要带有弱CYC1启动子,这是因为异源性蛋白过度表达其自身就可激活报告基因。在这种质粒中,CYC1基因的UAS2序列大部分都已缺失,从而产生一个弱的、非诱导型启动子。以这种表达水平,我们已经成功检测过许多蛋白。),另外还有一个多克隆位点(multiple cloning site, MCS)以及一个Cub- TF表达盒(注:根据蛋白的拓扑结构学( I型还是II型膜蛋白),可将所感兴趣的膜蛋白X相应地融合到Cub-TF盒的N-端(X- Cub -TF)或C-端(TF- Cub-X)。)。pX-Cub- TF和pTF-Cub- X具有LEU2选择性标记(图3A)。

采用5'末端带限制性内切酶序列的寡核苷酸,通过PCR对目的基因进行扩增。这样限制性内切酶序列也存在于诱饵载体的多克隆位点里(pX-Cub-TF 是XbaI, SpeI, PstI, Hind,而pTF -Cub-X是NdeI, NheI, PstI, SpeI, XbaI,SaclI)。使用相应的酶对PCR片段和pY - Cub - TF/pTF - Cub- Y诱饵质粒进行酶切消化,并连接。接着再将质粒DNA转化大肠杆菌,并用限制性内切酶以及DNA测序来证实是否存在插人片段以及其方向是否正确。

3.1.1.2 pNubG-HA- Y/pY- HA-NubG“猎物”载体

“猎物”载体pY-HA-NubG以及pNubG一HA一Y带有2pm长的复制起点,从而可以产生高拷贝数(每个细胞10~30个拷贝)。它们由组成性的ADH1启动子,NubG结构域,以及HA标签构成。其多克隆位点所处的位置使得外源基因可插人到N-端或者是C-端与NubG融合。这两种猎物载体都耐TRP1选择性标记(见图3B)。使用唯一的限制位点(pY- HA- NubG是NdeI, NcoI, SmaI, BamHI, pNubG- HA-Y是NcoI,SmaI, BamHI, PstI)将目的基因融合到NubG表达盒框内。

用于膜蛋白研究的酵母双杂交系统的载体

图3 用于膜蛋白研究的酵母双杂交系统的载体。

(A) 诱饵载体pX - Cub - TF以及pTF - Cub- X的构建是通过将Cub- TF/TF - Cub表达盒插 人到p415CYC1的多克隆位点(MCS)[20]。而外源基因序列被引入到Cub 多克隆位点的N-端(XbaI, SpeI, PstI, HindI限制性位点)或C- 端(NdeI, NheI, PstI, SpeI, XbaI, SacII 限制性位点)。

(B)通 过将NubG盒插人到p414ADH的多克隆位点可构建“猎物”载体pPY一 HA- NubG和pNubG - HA- Y。 外源基因序列被引人到NubG多克隆 位点的N-端(NdeI, NcoI, SmaI, BamHI限制性位点)或C-端 (NcoI, SmaI, BamHI, PstI限制性位点)。

3.1.1.3构建文库

pNubG-HA-Y和pY-HA-NubG文库的构建可采用传统的Gubler - Hoffman方法,将克隆的cDNA插人到多克隆位点唯一的“X"位点上。可使用标准实验方案来构建文库。为构建一个cDNA文库,可对表达目的基因的细胞或组织提取mRNA,并使用Oligo - dT引物经逆转录合成cDNA。可将带有单个限制性核酸内切酶识别序列的寡核苷酸连接子连接到双链的cDNA产物上,同时要让插人片段很容易插人“猎物”质粒多克隆位点的“Y”位点里。最后,使用琼脂糖CL- 4B柱将cDNA回收,并连接到pNubG-HA- Y和pY- HA - NubG载体,再转化大肠杆菌。

3.1.2酵母转化

在克隆之后,将“诱饵”和“猎物”质粒独自转染酵母报告菌株,并采用Westem blot检测蛋白的表达情况。其次,对转染的酵母菌落进行滤纸分析以检查相应的蛋白X -Cub- TF/TF-Cub-X和Y- HA- NubG/NubG- HA- Y是否会自我活化。

1.将L40酵母菌于30°C,30ml YPD培养基中培养,以200rpm 转速摇床生长至2X10/ml (相当于ODo0约等于1.0)。

2.将其置于消毒过的50ml Falcon管内以1700g离心5min。

3.用40ml消毒过的蒸馏水重悬细胞,并涡旋混匀。

4.再次以1700g离心5min。

5.弃上清,加人1ml冷的消毒过的蒸馏水。

6.以100ul为单位将其分装于Ep管中。

7.按顺序加人: 240ul PEG4000 (50% w/v), 36pl 1mol/LLiOAc, 5pl单链载体DNA (10mg/ml),以及5~ 10ug质粒DNA (pX-Cub-TF / pTF- Cub-X或pY- HA - NubG/pNubG-HA - Y)。

8.剧烈旋涡混匀,于42°C热休克25min。

9.以1000g离心1min来收集细胞。

10.小心弃去上清,并用100ul的消毒蒸馏水重悬细胞。将它们接种铺到一种选择性培养皿上,SD- Leu用于转染了“诱饵”质粒的L40菌,而SD- Trp用于转染了“猎物”质粒(pY -HA - NubG/PNubG-HA- Y)的L40菌。于30°C培养,大约3~4天后应该可出现转化子,但这依赖于菌株和选择性标记。

3.1.3提取蛋白质

根据表达蛋白在细胞内定位情况,可使用一种单转染的酵母菌落来提取胞浆蛋白以及膜蛋白。挑取3~4个单独的克隆接种到一个新的选择性培养皿上,并于30°C孵育2~3天。

1.将每个集落接种于50ml相应的选择性培养基里,于30°C,200rpm的转速摇荡生长至2X107 /ml (OD600约为1. 0)。

2.将其置于50ml的Falcon管中,以1700g离心5min。

3.弃上清,加入1ml冰冷的裂解缓冲液,通过涡旋重悬。

4.将其转移到2ml的Ep管中,并用300ul的玻璃珠加满。

5.间隔30s,剧烈旋涡混匀(在每步涡旋混匀间歇时,冰上冷却1min),重复7次。

6.用小离心机以700g、4°C 离心20min。

7.小心将上清转移到一个新的Ep管中,再次离心10min。

8.转移上清至微量离心管中,并以150 000g超速离心2h, 4°C。

9.收集上清(即胞浆蛋白)以及用100ul的裂解缓冲液吹打重悬片状沉淀(即为膜蛋白)。

10.取适当体积进行蛋白定量,分装样品,可先于液氮中冰冻, 再将样品管冻存于- 80°C。

3.1.4 Westerm Blot分析

为了检测融合蛋白的表达情况,对提取的蛋白进行SDS一PAGE,并将其转移到醋酸纤维膜上。用单克隆HA抗体(针对NubG盒的HA表位标签)或VP16的多克隆抗体(针对Cub- TF盒上的VP蛋白)来检测。同时用转染了空诱饵和猎物载体的酵母提取蛋白上样,作为对照。

1.对30μg的蛋白样品加入SDS样品缓冲液混匀,煮沸3min。

2.上样后,采用标准实验方案进行SDS PAGE。

3.使用电转槽进行转膜。

4.将膜置于封闭液中进行非特异性封闭1h,室温即可,也可置于摇床上。

5.用漂洗液稀释一抗(1 : 1000)于室温下孵育1h。

6.用漂洗液洗膜3次,每次5min。

7.用辣根过氧化物酶偶联的二抗孵育膜1h (二抗也可用漂洗液稀释,可参照提供商推荐的比例)。

8.漂洗3次,每次5min,再用不含有Tween 20的漂洗液漂洗5min。

9.化学发光(注:由于X- Cub- TF/TF- Cub-X融合蛋白的表达水平较低, 故在进行Westernblot时可采用增强型的化学发光剂来发光(Pierce,见材料))。

10.用X-胶片曝光显影。

3.1.5滤纸分析法检测 β -半乳糖苷酶活性

在检查融合蛋白的表达之后,单独转染有pX- Cub- TF/pTF -Cub- X诱饵质粒的酵母菌落可用来检测它们自身激活lacZ报告基因的能力。

1.对于每种单独转染,都挑取3~4个单独的克隆接种到一个新的选择性培养皿上并孵育2~3天(30°C)。

2.剪与培养皿相同大小的3MMWhatman滤纸盖在酵母菌落上10min。这可以使菌落黏到滤纸上。

3.用针小心挑取滤纸并转移到液氮中,保持5min。

4.将滤纸铺在一个培养皿上,带有印迹的这面朝上,于室温下融化数分钟。

5.用0.5% (v/w) 琼脂(溶于1XTBS,其含有10mg/L的X-Gal)覆盖过滤纸。于室温下让其聚合30min。将培养皿至于孵箱(30°C) 直至出现蓝色(一般为30分钟到数小时之间)。假若这些蛋白质会自身激活,应该考虑有两种可能(注:对于这种用于膜蛋白研究的酵母双杂交分析系统一个很重要的考虑是,是否包括了一个信号肽来指引这种异源蛋白进入分泌性通路。为了改进异源性膜蛋白到内质网的靶向作用,应该使用一种酵母信号肽, 比如从Ste2p (前14个氨基酸碱基为MS DAA PSL SNL FYD)或(前85个氨基酸碱基为MRFP SIF TAV LFA ASS ALA APV NTT TED ETA QIP AEA VIG YSD LEG DFD VAV LPF SNS TNN GLL FIN TTI ASI AAK EEG VSL DKR)产生的K EEG VSL DKR。然而,在许多时候,在没有添加一个酵母信号肽时,这种异源性蛋白将以膜为靶标(。另外一个考虑是,对酵母菌株的选择,因为异源性蛋白表达很可能通过酵母内自身存在的机制发生蛋白降解,这种降解可以通过使用酵母蛋白酶缺陷菌株YPH420来避免发生),并采取相应的补救措施。

3.2使用这种用于 膜蛋白研究的酵母双杂交系统来检测蛋白质间的相互作用

在证实酵母内有融合蛋白的表达,而且不会自身激活lacZ报 告基因之后,对酵母菌可进行“诱饵”和“猎物”质粒的共转化来 检测它们潜在的相互作用。

3.2.1配对相互作用检测

采用先前描述的方法(3.1.2)对L40报告菌株进行转化,注 意这是将“诱饵”和“猎物”质粒起转化到同一细菌中。 转染体 首先在SD-Leu-Trp培养皿上培养选择证实两种质粒是否存在, 接着再系统地挑取克隆接种到SD- Leu- Trp- His培养基上以检 测His3报告基因的表达(注:作为共转化的阴性对照,在筛选之前,pY - HA - NubG/pNubG-HA-X质粒应该转化到有诱饵蛋白表达的酵母菌里,而pX-Cub- TF/pTF - Cub- X应当转染到有“猎物”蛋白或文库表达的酵母菌里。假若酵母菌落能在选择性培养基(SD- Leu- Trp- His)上生长, 那背景生长可使用3-AT (3 -amino-1, 2, 4- trizole)来抑制,后者是一种酵母His3p蛋白的广谱抑制剂。但应该对所使用的3 - AT浓度进行浓度依赖测试(例如以5,10,15,20,30,40,50mmol/L 逐步递增)。使菌株不再能够生长的最低浓度可用来进行文库筛选。)。再采用前述的滤纸分析法(3.1.5)检测lacZ报告基因。

3.2.2文库筛选

用文库筛选的方法,将融合到NubG的一个相应基因组成的 cDNA文库转染到表达所感兴趣的诱饵膜蛋白的酵母株。 1.将表达有X-Cub-TF/TF-Cub-X融合的L40酵母株接种 于200ml的选择性培养基SD- Leu上,于30°C摇床过夜生 长,转速200rpm。

2.将过夜培养的培养物用1.0L的YPD培养基来稀释到起始 OD600为0.3左右。

3.当培养到OD600为0.8~1.0时,以1700g, 4°C,离心15min。

4.用250ml消毒蒸馏水经涡旋,重悬细胞。

5.以1700g, 4°C,离心15min。

6.弃上清,并加入冰冷的消毒蒸馏水20ml。

7.分装上述细胞于四个消毒过的50ml Falcom管中,并以1000g离心5min。

8.小心弃除上清,每管加入8ml消毒过的冰冷蒸馏水。

9.涡旋混匀。每管加入12ml PEG4000 (50% w/v), 1.8ml的 1mol/L LiOAc, 0. 25ml (10mg/ml)单股载体DNA以及文 库(50~100μg)。

10.用冷消毒过的蒸馏水给每管加到18ml,并剧烈涡旋混匀5min。

11.将管置于旋转轮上,室温下转动30min。

12.在摇床上以200rpm摇动30min时,于42°C热休克。

13.以1000g, 4°C离心5min收集细胞。

14.小心弃去上清,并用10ml冷消毒过的蒸馏水重悬。

15.取100pl重悬细胞接种到SD- Leu- Trp培养皿上,稀释梯度 为10-4~10-1。

3.2.3滤纸分析检测β-半乳糖苷酶活性

对任何His阳性的菌落可采用如3.1.5描述的X- Gal滤纸分 析测试进行检测。

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