哺乳动物细胞双杂交分析是一种 用来研究体内蛋白质相互作用的方便而有效的工具。这种方法比起大家所熟知的酵母双杂交分析的一个主要优点是，它可用于研究酵母内没有正确折叠，或者是酵母内通常不存在、需要翻译后修饰或外来刺激才表达的蛋白质之间的相互作用。

哺乳动物双杂交分析类似于众所周知的酵母双杂交分析，从原理上讲，这两种方法都是基于这样一个事实， 即许多真核细胞的转录激活子都由两个在实质和功能上都独立分开的模块组成:一个是DNA结合域(DNA-binding domain, DBD,图1中的“D")，它可特异性结合到一个启动子/增强子元件上;另一个是转录激活功能域(transcriptional activation domain, TAD,图1中的“A”)，它可指导RNA多聚酶Ⅱ去转录DNA结合位点下游的基因。对于一个天然的转录因子来说，成功的转录激活需要这两个功能域的共同参与(图1Ⅰ)。 相比之下，如果TAD不能与DBD结合到启动子上，这两个结构域的独立表达并不会激活报告基因(图1Ⅱ)。

图1 哺乳动物双杂交分析原理。 “O”和“A”分别指DNA结合功能域和转录激活功能域。大多数转录因子是都包括一一个D和A (Ⅰ)。缺乏“A”可导致转录活性的丧失(Ⅱ)。 “D"和“A”可用通过分别融合到“D”和“A”上的两种有相互作用的蛋白质(X与Y1)而连接到一起(Ⅲ)。然而，与X并不发生相互作用但与A融合的蛋白，比如Y2,并不能恢复D-X融合蛋白的转录活性(Ⅳ)。

在双杂交分析里，这种连接就是一种 蛋白质间的相互作用(即图1Ⅲ中的X和Y1)，它们二者分别融合到TAD和DBD而各自独立表达。在哺乳动物双杂交分析里，通常使用酵母转录因子Gal4的DBD和一个位于病毒强激活子VP16羧基端的78个氨基酸内的酸性TAD。比起酵母双杂交分析，哺乳动物双杂交分析的一个主要优点是可用于研究哺乳动物细胞系内的蛋白质间的相互作用。因此，这就使得我们可用其研究那些酵母没有被正确折叠的以及酵母内通常不存在的、需要翻译后修饰( 即磷酸化)或外来刺激诱导表达的蛋白质间的相互作用。

材料

材料
1.大肠杆菌感受态细胞(DH5a或其他适合的菌株; Invitroge cat. no. 18265017)。	2.碱性磷酸酶，小牛小肠(CIAP; NEW England Biolac cat. no. M0290)
3.限制性内切酶和T4 DNA连接酶(New England Biolabs)。	4.连接缓冲液(1 X ): 50mmol/L Tris+ HCL，pH 7.5,10mmol/L MgCl2, 10mmol/L二硫苏糖醇，1mmol/L ATP,25mg/ml牛血清白蛋白。
5.琼脂糖凝胶装置。	6. Luria-Bertani (LB) 培养基(含以及不含氨苄青霉素)及琼脂平板(含氨苄青霉素) (50ug/ml; LB肉汤培养基，Invitrogen, cat. no.12780029)。
7. pCMX - Gal4- N Gal4 DBD融合克隆载体也可用pM载体，购自Clontech, cat. no. K1618-1)。	8.pCMX-VP16-NVP16TAD融合克隆载体或pVP16载体，Clontech, cat. no. K1618- 1)。
9. pFR - Luc报告质粒(Stratagene, cat. no. 219050)。	10. pCMX - Ga14- VP16阳性对照载体。
11. pCMX- Gal4- ASC- 2阳性对照载体。	12. pCMX- VP16- RAR阳性对照载体。
13.适合用于哺乳动物细胞培养的培养基。例如，DMEM(Invitrogen,cat. no. 11995065)。	14.胎牛血清(FBS) (Invitrogen, cat. no. 10082139)。
15. D- PBS (Dulbecco磷酸盐缓冲液) ( Invitrogen, cat.no.14080055)。	16.1X胰酶EDTA (Invitrogen, cat. no. 25200056)。
17.全反式维甲酸(0.1 ~ 1μmol/L; Sigma Aldrich, cat. no.R2625)。	18. Lipofectamine 2000 (Invitrogen, cat. no. 11668 - 019)或其他合适的转染试剂，若采用前者还必配备Opti-MEMI(Invitrogen, cat. no. 31985)。
19.哺乳动物细胞(如HeLa, CHO, CV-1, COS, 293 以及NIH3T3)。	20.荧光素酶分析试剂盒(细胞裂解液; Promega, cat. no.E 1531以及荧光素酶分析缓冲液; Promega, cat. no. E 1483)。
21.细胞培养板(24 孔; Costar, # 3524)。	22.荧光光度计(MicroLumat Plus LB 96V, Berthold Technolo-gies)。

方法

下面按三个方面描述方法:①构建嵌合表达质粒，②转染质粒到细胞，③测量荧光素酶活性。

3.1表达质粒

以下描述如何构建编码两个融合蛋白的质粒。这包括Gal4DBD-融合载体pCMX一GA14-N以及VP16TAD-融合载体pCMX- VP16-N (由Ron Evans博士提供)。通过限制性内切酶消化或PCR扩增，编码诱饵蛋白的DNA被插人到pCMX - Ga14-N,而编码靶蛋白的DNA被插人到pCMX- Vp16- N。编码诱饵或靶蛋白的DNA必须在相同的读码框分别表达为Gal4DBD和VP16 TAD。尤其是，通过使用一个PCR引物，在目的基因的末端要引入一个合适的限制性位点，这便可以在期望的地方和读码框掺人一个预设的限制性内切酶位点。对于那些有多克隆位点(multiple cloning site, MCS)的载体，它们可提供9个独特的位点而方便地进行克隆实验(图2A、2B)。

图2 两种融合载体和报告基因的示意图。(A) pCMX-Ga14-N包含了巨细胞病变(cytomegalovirus, CMV)启动子。T7启动子，Gal4-DBD的编码序列，多克隆位点(MCS)以及PolyA位点(PA)。(B)pCMX- Vp16- N包含了巨细胞病毒启动子。T7启动子，VP16的编码序列，多克隆位点以及PolyA位点。行(C) pFR- Luc报告质粒(Stratagene, cat. no. 219050)包含了五个连续的Gal4结合位点，TATA盒，荧光素酶的编码序列以及PolyA位点(见注释6、7)。

3.1.1克隆

载体经限制性核酸内切酶消化以及用CIAP进行脱磷酸化后，再与插人DNA片段进行连接。例如，在含有50mmol/L NaCl,100mmol/L Tris一HCl, 10mmol/L MgCl2, 0. 025% Triton X -100，pH7.5的20pl总反应体积里加人1个单位的EcoRI限制性内切酶，将1μg的pCMX- Gal4-N于37C消化1小时。反应结束，加入0.5单位的CIAP,混合后37°C孵育1小时。将EcoR I消化过的插人片段(也就是ASC-2)与EcoR I消化过的pCMX -Gal4-N加入T4连接酶-起孵育进行连接反应(见下述)。假若使用三个限制性内切酶，对DNA进行琼脂糖凝胶电泳，并采用电解洗脱两个限制性内切酶位点之间的小片段，便可得到理想的质粒条带，从而降低背景(即再次连接的载体)。其他方法包括玻璃珠吸附以及使用低熔点的琼脂糖凝胶，也可用于对DNA的抽提和纯化。经纯化和乙醇沉淀后，用TE缓冲液重悬DNA。

3.1.2连接插入片段

对于连接，比较理想的插入片段与载体DNA的摩尔比是变化的。通常，起始推荐为2 : 1。采用先前文献报道的方法，将包含载体、插人片段、T4 DNA连接酶以及连接缓冲液的反应液于室温(22℃)反应2h或4℃~16℃过夜。降低ATP浓度至5mmol/L,并过夜孵育(12℃~14℃) 有助于平末端连接。

3.1.3转化

从-80℃冰箱取出100ul感受态细菌于冰上融化，加人2μl连接反应液放置于冰上30min。在42°C水浴槽内孵育90s后迅速转移到冰上，让细胞在2min内迅速冷却。再加入1ml LB培养基并在37°C孵育30min至1h,将已转化的细胞铺于LB -氨苄青霉素琼脂平板，并于37°C孵育过夜。

3.1.4验证插入中段及读码框

采用小提克隆，对pCMX- Gal4- N或pCMX - VP16- N载体是否含插人的DNA片段进行验证。方法可采用碱法制备或煮沸的方法。插人DNA的核酸序列应该测序鉴定，确信插人片段位于Gal4 - DBD或VP16 - TAD的读码框内，而且插人片段应该没有突变。此外，应采用针对表达DNA插人片段或Ga14DBD的蛋白的载体进行Western blot分析，以此来证实Gal4 DBD诱饵融合蛋白是否表达。同理，采用针对表达DNA插入中段或VP16 TAD的蛋白的载体进行Western blot也可用来证实VP16 TAD -靶蛋白的存在。例如，我们用一个抗RAR的抗体进行Western blot分析来证实，在含有pCMX - VP16- RAR的转化细胞里有VP16/RAR的表达。

3.2瞬时转染

用于哺乳动物双杂交分析质粒DNA,基本上都要求有两个报告基因，-个是包含Gal4结合位点(Gal4 - binding site, UAS),Ga14诱饵DNA, VP16靶DNA的多个拷贝。而另外-一个是用来标化转染效率的(见下述)。可采用多种方法将质粒转染进哺乳动物细胞内(如磷酸钙沉淀法，脂质体法，电穿孔法，病毒感染法等)。我们已习惯采用Lipofetamine 2000 (Invitrogen) 进行转染。在不同的细胞系转染效率有所不同，对某种宿主细胞比较好的方法很可能并不适合另外- . 种细胞。因此，在首次使用一种细胞系时，应对比不同转染方法的转染效率，-旦确定某种方法后， 随后再对各种参数进行优化，比如细胞密度、DNA总量和纯度、培养基条件及转染时间等(见注释1)。一旦这些参数确定后，就应保持不变，从而可保证实验结果的重复性。无论是哪种方法，依赖于所使用的宿主细胞系，荧光素酶的活性-般均可在转染后 的36~48小时内进行检测。对于定量来说，至少需要进行2~3次的转染，从而对结果取平均值。推荐也可使用一个固定量的第报告基因进行共转染来标化转染效率。结果以第-个报告基因与第 二报告基因的比值来统计。

3.2.1报告质粒

许多能与Ga14结合位点上游反应的报告质粒均可以采用，包括pGal4 - Luc。我们通常使用pFR - Luc ( Stratagene; SanDiego, CA)，它包含了photinus pyrais (萤火虫)荧光素酶基本启动子元件(TATA盒)下游的完整编码序列，并加入了5个17bp Gal4结合元件的串联重复序列(图2C)。

3.2.2哺乳动物细胞的培养生长

以下方案适用于黏附细胞系，比如CHO, CV- 1, NIH3T3,HeLa以及HEK293。对于其他细胞系，也都有其相应的最适合的培养基及培养条件。

1.融化并接种已复苏的细胞于含全培养基的组织培养瓶里。

2.当细胞生长到刚好融合时传代细胞。

3.每2~3天进行传代培养，接种密度为(1~2)X105 /ml。

4.以(0.5~1.0)X 105个细胞接种于含lml全培养基的24孔板。

5.于37°C CO₂孵箱内孵育过夜。

3.2.3制备 DNA混合物进行转染

用干净消毒过的小管来混合待转染的质粒。每次分析都需要重复2~3次。每管内质粒DNA的总量应够用于2~3次转染(参见注释2、3、5)。对某一种具体的细胞系来说，应该先进行预试验来确定最佳的DNA浓度(通常每孔为200~1000ng)。

3.2.4转染细胞

许多方法均可用于转染，如磷酸钙沉淀法、脂质体法。在不同的细胞系及实验条件下，其转染效率有所不同。根据实验操作手册，转染程序可进行优化。以下是我们采用Lipofectamine 2000进行实验的操作指南。

1.用50ul的Opti-MEM I稀释DNA。

2.将2μl的Lipofectamine稀释至50μl的Opti - MEMI,并在室温下放置5min。

3.混匀已稀释过的Lipofectamine及DNA,室温下孵育20min。

4.加入100ul的DNA-Lipofectamine混合液到每孔，并轻柔混匀。

5.于CO₂孵箱里，37°C培养36~48小时。

3.3荧光素酶分析

1.对转染后24小时的24孔培养板去除培养基，并用0.5ml的1X PBS液轻柔地清洗两遍。

2.用移液器或吸量管尽可能吸干净残余的PBS后，每孔加人100pl1X细胞裂解液，轻柔摇晃以确保裂解液盖过细胞。

3.室温下静置15min,中间间断轻摇培养板。

4.于2小时内直接测定每孔的荧光素酶活性(参见步骤6)。假若细胞裂解产物较为黏稠，可先离心，取上清。

5.为了以后分析可冻存标本。可将每孔的溶液转移至一个独立的微量离心管。全速离心后，将上清冻存于-80°C。值得注意的是，反复冻融会导致荧光素酶活性的丢失，可多达50%。

6.取5~20μl的细胞裂解液(来自第4或5步;见注释4)置于96孔板，将培养板置于光度计样品室内，其配备了一个自动注射器，采用1X荧光素酶分析缓冲液(100pμl) 进行校零。

7.用光度计于10~30s内测定反应液的发光强度。

8.荧光素酶活性可表达为相对光强度单位(relative light unit,RLU) (见注释 4、5)。活性也表示为RLU/孔, RLU/细胞数或RLU/细胞总蛋白，见图3的例注。

图3 (A) 来源于pCMX - VP16/RARVP16/RAR,其结合全反式维甲酸后出现构象变化，它可以与衍生于pCMX - Ga14/ASC- 2的Gal4/ASC- 2发生相互作用(见注释8)。这种蛋白质与蛋白质的相互作用带着转录激活结构域VP16到PFR-LUC报告基因上，从而转录荧光素酶的mRNA并翻译出其蛋白质。(B) 在RA存在下，只有当Gal4/ASC-2与VP16/RAR一起共表达时，荧光素酶活性才会明显增加。作为阳性对照，可将Gal4融合到VP16 (见注释9、10)。

注释

1.用于转染的DNA质量必须要很高(即呈双氯化铯带)，质粒DNA应该不含内毒素，且OD_260/280比值接近1.8~2. 0。

2.理想的饵/靶DNA摩尔比是可变的。通常使用等摩尔量的Ga14 DBD和VP16 TAD靶DNA作为起始点进行实验，再使用不同比例的饵/靶DNA来优化结果。

3.许多蛋白常常包含了一个隐匿的自发转录激活功能，虽然这在转染中并不起多少作用，但这可使得背景显著增强而令人难以接受，如果是这样，可选择VP16 TAD融合来表达蛋白，而不应选择Gal4 DBD融合。

4.当荧光素酶活性太低而不能计算时，可适当增加细胞裂解产物的浓度，或者增加pFR - LUC报告质粒的量来进行转染。

5.为了避免荧光素酶活性只比背景有轻度增加，不应使用过多的pCMX- Ga14-N和pCMX - VP16- N。

6.pCMX-Ga14-N表达出的Ga14DBD有其自身的核定位信号。然而，来自pCMX- VP16-N的VP16 TAD都缺乏，因此，研究人员必须确定被插入到pCMX-VP16-N载体的目的基因必须自己带有自身的核定位信号，或者在克隆过程中引人一个核定位信号。这对于研究非核蛋白或核蛋白片段尤其重要，因为它们很可能因为缺失核定位信号而不能正确地入核。目前已有商业化的带-一个核定位信号的VP16融合载体可供利用，比如pVP16 (Clontech, Palo Alto, CA)。

7.由于可能存在融合结构域的抑制作用，推荐应该进行双向的蛋白质-蛋白质相互作用的检测(也就是在Gal4 DBD与VP16 TAD之间进行插入片段的交换)，研究人员也可在Gal4 DBD和VP16 TAD之前表达他们的目的基因，从而避免这种抑制效应。

8.编码一个Gal4融合蛋白到VP16的pCMX- Gal4- VP16可用来作为阳性对照(图3B)。另外，我们已常规化使用pCMX - VP16/RAR和pCMX - Gal4/ASC- 2进行对照实验来验证哺乳动物双杂交分析。维甲酸受体(retinoic acid,RAR)在结合维甲酸后可引起构象变化，一个转录共激活子ASC- 2可直接识别这种结构变化(图3A)。因此，这种Ga14/ASC-2与VP16/RAR之间的蛋白质-蛋白质相互作用是一种严格地依赖维甲酸的方式，见图3B的例注。

9.一旦这两种蛋白的相互作用在哺乳动物细胞内被检测到，哺乳动物双杂交分析可结合缺失或位点定向突变的方法对这种相互作用进行功能性分析。哺乳动物双杂交分析也常用来证实那些经酵母双杂交分析筛选证实的蛋白质蛋白质相互作用的关联程度。这种验证可减少假阳性的概率，它是酵母细胞内实验的一种假象。

10.哺乳动物双杂交验证的这种蛋白质蛋白质相互作用可以是由一些内源性接头蛋白来介导的。因此，应该采用已纯化的蛋白来进行蛋白质-蛋白质相互作用分析，从而可克服这种影响。

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