1.膜蛋白酵母双杂交为啥一定要做功能验证？

将PBT3-N-bait（诱饵质粒）与pOst1-NubI（功能验证阳性对照质粒）共转NMY51酵母宿主菌即为功能验证组，基本原理为NubI不依赖猎物蛋白能单独与Cub结合，从而激活报告基因。从而证明诱饵蛋白适用于膜体系实验。
钟小博“墙裂”建议：功能验证实验是在膜系统酵母双杂筛选之前必须要完成的。如果功能验证结果为阳性，可以排除由于诱饵bait蛋白造成的空间位阻而产生假阴性，同时能说明Bait-Cub跨膜蛋白正常表达，因此能够确认bait蛋白可以用于下游的文库筛选。

2.膜蛋白酵母双杂交功能验证的原理是什么？

将PBT3-N-bait（诱饵质粒）与pOst1-NubI（猎物质粒）共转NMY51酵母宿主菌即为功能验证组。

(1)、先介绍猎物组，pOst1-NubI会在宿主中表达Ost1-NubI融合蛋白, 其中Ost1是一种驻留ER蛋白，确保Ost1-NubI融合蛋白定位在靠近细胞膜的胞质区；NubI是野生型泛素蛋白ubiquitin的结构域，能够主动吸引诱饵质粒表达的的Cub结构。

(2)、再介绍诱饵组，PBT3-N-bait会在宿主中表达bait-Cub-LexA-VP16蛋白，其中Cub-LexA-VP16部分位于膜的胞质侧，Cub对NubI有强烈亲和力。

(3)、当猎物与诱饵转化成功，在宿主同时表达，bait-Cub-LexAVP16与Ost1-NubI发生“亲密”结合形成完整的分裂泛素蛋白结构，UBPs识别分裂的泛素并通过蛋白水解裂解释放LexA-VP16转录因子，游离的LexA-VP16易位到细胞核并激活报告基因，从而NMY51菌株即可在筛选培养基上生长。

3.膜蛋白酵母双杂交的阳性对照是不是功能验证？

在膜体系的双杂筛选实验中，阳性对照跟功能验证是两回事。阳性对照组的目的是确认实验体系及操作过程正确，而功能验证则是验证诱饵蛋白是否适用下游筛库实验。

将pTSU2-APP（阳性诱饵质粒）和pNubG-Fe65 （阳性猎物质粒）共转NMY51酵母宿主菌即为阳性对照组。APP (amyloid A4 precursor protein) 诱饵蛋白和Fe65 (amyloid beta A4 precursor protein-binding family B member 1) 猎物蛋白发生相互作用，启动泛素分离机制，激活报告基因，从而能在选择性培养基上长出阳性克隆。

4.做膜蛋白酵母双杂时需要用Western Blot来确认Bait蛋白是否表达吗？

先直接说结论，大可不必。

诱饵蛋白为膜蛋白，本身表达产量就很低，此外提取膜蛋白的过程也比较繁琐，一通操作下来，一点膜蛋白也折腾的差不多。即使Western Blot阴性也不能说明Bait蛋白没有表达，
以钟小博的浅见，只要功能验证实验是阳性，即可进行下游筛库实验。

5.酵母双杂中膜库和核库是一回事么，有什么区别？

核文库与膜文库从本质上来说其实是同一种cDNA初级文库，只是被连接到了不同的诱饵质粒上，就像是同一个钟小博，分别穿上了泳衣（核载体）和滑冰服（膜载体），适用于不同的场景。

无论是膜文库还是核文库，首先都需要获得cDNA初级文库，一般的程序如下（以gateway文库为例）

核文库是将初级文库质粒（pDONR222-cDNA）通过gateway同源重组的策略亚克隆至核文库质粒pGADT7-DEST-***cDNA

膜文库是将初级文库质粒（pDONR222-cNDA）通过gateway同源重组的策略亚克隆至膜文库质粒pPR3-N-***cDNA

6.看到网上有公司打出酵母文库“一库四用”的说法，是夸大宣传还是真有特殊的技术？

举个“栗子”，钟小博的手有多个应用场景，可以拿勺吃饭、可以划手机、可以做酵母双杂实验、可以挖鼻孔。钟小博也可以傲娇的说，“一手四用”，究其根本还是“手”的基本用途，所谓的一库多用，是指双杂核系统筛选、酵母单杂筛选、酵母三杂等，都可以使用同一个文库，这本来是科学家基于文库的原理开发出来的多场景应用。

7.膜系统筛选时做酵母转化时转化效率很低，有什么解决办法吗？

没有一劳永逸的金手指，其实所有的解决办法都在实验操作中，钟小博为您一一道来

(1)、确保单链DNA为新鲜的且保存于-20°C。多份分装，分批使用，解冻后保持在冰上4°C，避免反复冻融。

(2)、条件允许的情况下，单链DNA在使用前，在95°C下变性两次5分钟效果更佳。

(3)、确认PEG溶液浓度为50%，使用过程中快取快用，避免蒸发。

(4)、使用新鲜培养的酵母菌株，培养皿中生长超过两周的酵母属于油腻中年，不推荐用于转化实验。

(5)、确保培养基为新鲜配置的，并且经过高温灭菌。DMSO加入到培养基中后，立即通过摇动混合细胞，42°C水浴孵育20分钟，营造良好的转化环境。

(6)、设置好阳性和阴性对照，当实验结果出现异常情况时，有判断的依据。

8.酵母双杂实验中，用膜文库筛选出来的一定是膜蛋白吗？

这个可不一定，我们构建的膜文库质粒，是在猎物蛋白的N端融合了NubG，无论猎物蛋白是胞内蛋白，还是一部分蛋白穿膜，只要猎物蛋白能够与诱饵蛋白靠近互作，Cub与NubG就能形成功能ubiquitin，从而启动下游报告基因显示出阳性。因此，筛到的蛋白可能是定位在膜上，也可能不是。
从钟小博接触的大量实验实验数据显示，膜系统筛选获得的阳性蛋白除了膜蛋白外，甚至有可能是核蛋白、叶绿体蛋白、线粒体蛋白等其他亚细胞器的蛋白。

9.酵母双杂膜文库中NubG-X文库和X-NubG文库有什么区别吗？

将初级文库重组进pPR3-N载体中，形成的文库就是NubG-X文库，这里的X就相当于猎物蛋白，NubG融合在猎物蛋白的N端；反过来，X-NubG使用的是pPR3-N载体，将NubG置于诱饵蛋白的C端。一般情况下，我们使用NubG-X文库。

10.膜文库构建过程中，是否需要加三框接头呢，会不会额外加收费用？

使用Gateway方法构建酵母文库，添加三框接头是标准的操作步骤，我们的建库费用中已经包含了这步骤的费用，因此不会额外增加费用。有不少新手不理解三框接头是什么，钟小博简单科普下：获得的cDNA序列插入到文库载体上，但cDNA起始碱基不一定是三联密码子的第一个碱基，当起始碱基从三联密码子的二、三位开始时，整个序列就会发生移码。因此我们设计三种不同的接头，给每一个cDNA序列都加上三种起始碱基的接头，这就可以保证，至少有一条序列可以正确的编码猎物蛋白。

11.做膜库筛选时，筛到多少个阳性克隆才算正常？

只要功能验证为阳性，阴阳性对照组正常，自激活能得到抑制，实验过程严谨规范、没有出现重大的误操作，出现多少个阳性都是正常的。
据钟小博多年的筛库实践经验来看，我们选取生长5天左右的平板，挑选独立的直径为2mm~5mm的克隆为阳性克隆，大概可以挑出来50~100个，经过四缺板复筛，去掉一些长不大或不变蓝的克隆，再经过测序比对后，去除一些重复的克隆，收获30~60个阳性克隆是比较正常的实验结果。

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