酵母双杂交文库构建服务案例

（限于篇幅，我们只选取了实验报告中部分步骤，如果需要了解更多的实验信息，联系我们。）

1、 Trizol法RNA的提取RNA电泳图如下：`

2、使用Oligotex mRNA Kits（Qiagen）分离纯化样本的mRNA，mRNA质量可以满足文库要求，mRNA总量为6.9 ug，电泳检测图片如下:

3、 酵母双杂交文库构建
3.1 cDNA第一链的合成
3.2 cDNA第二链的合成
3.3 cDNA adapter的制备
3.4 cDNA与attB1重组接头连接(三份接头各连一份)。
3.5 cDNA分级分离

4、 1、初级文库的构建
4.1 BP重组与电转化大肠杆菌DH10B
4.2 初级库容量的鉴定
取转化后细菌原液10 μL稀释1000倍后，从..中取出50 μL涂布LB平板（含相应抗性），37℃培养过夜第二天计数。
文CFU/mL= 平板上的克隆数/50 μL × 1000倍×1×103 μL
文库总CFU= CFU/mL × 文库菌液总体积（mL）
4.3 初级重组率和插入片段长度鉴定
随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，配制反应液，在AB 2720 PCR仪上进行PCR反应。 结果如下图所示：

重组率：24/24*100%=100%
重组率：重组成功数量/克隆总数*100%    平均长度：>1000b

初级文库库容量鉴定（库容量＞10⁷）

4.4初级文库扩增及质粒提取
将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养，第二天用液体培养基从平板上洗脱菌落，取其中2/3体积用Qiagen大抽试剂盒抽提质粒DNA，剩余1/3体积中加入25%无菌甘油混合均匀后灌装保种管，冻存于-80℃冰箱。
4.5初级文库文库菌保存和文库筛选
冻存于-80℃冰箱内，可以保存2年以上，初级文库质粒可以用于次级文库构建， 酵母双杂交初级文库菌的抗性为卡那霉素抗性。

5、次级文库的构建
5.1 LR重组与电转化大肠杆菌DH10B
5.2 次级库容量的鉴定
取转化后细菌原液10 μL稀释1000倍后，从..中取出50 μL涂布LB平板（含相应抗性），37℃培养过夜第二天计数。
CFU/mL= 平板上的克隆数/50 μL × 1000倍×1×103 μL
文库总CFU= CFU/mL × 文库菌液总体积（mL）
5.3 次级重组率和插入片段长度鉴定
随机挑取24个克隆进行菌落PCR鉴定，配制反应液，在AB 2720 PCR仪上进行PCR反应。
5.4次级文库扩增及质粒提取
将转化后原始文库菌液涂布氨苄抗性培养基平板扩增培养，第二天用液体培养基从平板上洗脱菌落，取其中2/3体积用Qiagen大抽试剂盒抽提质粒DNA，剩余1/3体积中加入25%无菌甘油混合均匀后灌装保种管，冻存于-80℃冰箱。
5.5次级文库文库菌保存和文库筛选
冻存于-80℃冰箱内，可以保存2年以上，次级文库可以直接用于酵母文库筛选， 酵母双杂交次级文库菌的抗性为氨苄抗性。

重组率：24/24*100%=100%
重组率：重组成功数量/克隆总数*100%    平均长度：>1000bp

次级文库库容量鉴定（库容量＞10⁷）

酵母双杂交文库筛选案例

一、试剂、耗材（略）仪器设备（略）试剂及配制 （略）
二、诱饵载体构建pGBKT7- Bait的构建与鉴定（此步骤为常规的实验方法，可以通过酶切、测序等方法鉴定酵母杂交诱饵载体正确性，此处略）
三、Bait自激活检测
3.1酵母转化反应
将各种质粒转入受体菌Y2H中，观察检测结果。

Reaction	AD plasmid	BD plasmid	涂板种类	备注
1	pGADT7-largeT	pGBKT7-p53	SD-TL	阳性对照
2	pGADT7-largeT	pGBKT7-laminC	SD-TL	阴性对照
3	pGADT7	pGBKT7-Bait	SD-TL	自激活检测
4	-	pGBKT7-Bait	SD-T	筛库备用

3.2 感受态酵母制备及酵母转化方法
1.将YPDA平板上的酵母，挑选一个菌斑，用1mL移液枪全部吸取，置于12mL摇菌管管装的3mL YPDA培养基中；30℃，250rpm培养过夜；
2.室温下700g离心5min，弃上清；用40mL新鲜的YPDA培养基重悬；30℃，250rpm培养3~5h，至OD₆₀₀至0.4~0.5；室温下700g离心5min，弃上清；
3.加入30mL无菌去离子水重悬；室温下700g离心5min，弃上清；用1.5mL的1.1X TE/LiAc重悬，装至2mL离心管；
4.高速离心15s，弃上清；加入1mL的1.1X TE/LiAc重悬，感受态细胞即制备完备,备用。
5.将Bait质粒DNA 300ng，变性鲑鱼精DNA 5μL，装在一个预冷的1.5mL离心管中。
6.加入50μL感受态酵母，轻轻混匀，不要用枪吹打；加入500μL的PEG/LiAc，轻轻混匀，不要用枪吹打。
7. 30℃水浴30min，每10min轻轻混匀一次。
8.加入20μL的DMSO，轻轻混匀。
9.42℃水浴15min，每5min轻轻混匀一次。
10.高速离心15s，去上清，加入1mL的YPD Plus培养基重悬，震荡培养90min。
11.高速离心15s，去上清，用1mL的0.9%NaCl重悬。
3.3 Bait自激活检测结果
pGBKT7-Bait + pGADT7共转化Y2H长出的酵母转化子随机挑取了6个菌落进行自激活检测。包括HIS3、ADE2、AUR1-C和MEL1共4个报告基因的检测。
HIS3和ADE2的检测采用点板培养的方法，将转化子点板至SD-TLHA平板，30℃恒温培养4天，观察其生长状态。
MEL1报告基因的检测方法如下：
1. 从转化平板随机挑取6个菌落于培养基上。
2. 将滤纸完全浸于液氮中90 s，取出常温放置2 min晾干。
3. 在培养皿中加入新鲜配制的显色液，一般9 cm培养皿用2-3 ml显色液。
4. 将显色液加入培养皿中，再放入一张干净的滤纸，让其完全浸湿，将冻溶后的滤纸放在最上面，使显色液浸透表层，盖上皿盖。30℃避光培养，20 min后开始观察，一般2 h后可开始看到颜色变化。4-5h拍照记录结果。

对照菌株在SD-TL缺陷平板上都能正常生长，而仅有阳性对照可在SD-TLHA缺陷平板生长。pGBKT7-Bait +pGADT7转化子中随机挑选的6个菌落在SD-TLHA缺陷平板上不能生长，生长状态同阴性对照，MEL1检测中结果也与阴性对照相同，因此不存在自激活。

自激活检测结论：Bait诱饵克隆没有自激活作用。

四、文库筛选
用含有正确pGBKT7-Bait诱饵质粒的Y2H酵母转化子作为受体菌制备感受态，将次级文库质粒转入其中，涂SD/-Trp/-Leu/-His平板。

五、影印清除
为了消除背景生长菌落的干扰，在培养到第3天时，用绒布对筛库平板进行影印清除后，继续培养7-14天。分批挑取再次长出的转化子菌落进行下一步检测。

六、阳性克隆鉴定
至影印清除后继续培养7-14天，从筛库平板中挑取长出的阳性克隆单菌落，共挑取到20个初始阳性克隆转化子转接到SD-TL缺陷型平板中继续培养2-3天。

6.1 阳性克隆His和Ade报告基因的检测
将上述SD-TL缺陷型平板上长出的20个初始阳性克隆转化子分别用无菌水稀释后点种至SD-TL和SD-TLHA缺陷平板，30℃恒温培养3-4天，结果如下图所示：

阳性克隆检测结果显示：在20个初始阳性克隆中，有13个能在SD-TLHA生长的是激活了ADE2和HIS3报告基因。

6.2 阳性克隆LacZ报告基因检测
将20个初始阳性克隆用无菌水重悬后点于培养基上进行MEL1报告基因检测。结果如下图所示：

七、酵母阳性克隆DNA提取和测序比对
通过测序比对，可以将重复的阳性给克隆子去除，本实验案例中，有多个克隆子为重复的阳性克隆，经过筛除后，我们可以确认获得了6个完全不同的阳性克隆子。

八、回转验证
用含有正确pGBKT7-Bait诱饵质粒的Y2H酵母转化子作为受体菌制备感受态，将6种阳性克隆质粒DNA分别转化其中，分别回转验证His和Ade报告基因的检测和MEL1报告基因检测。

实验结论：

本项目以Bait基因cDNA克隆为诱饵，筛选cDNA酵母双杂交文库，在筛选到的20个初始阳性中，经过鉴定结果显示有13个能激活ADE2、HIS3和LacZ报告基因。经过对这些阳性克隆质粒进行DNA测序和BLAST比对分析，结果表明它们分别属于6种不同蛋白的编码基因。 通过对这6种阳性克隆的回转验证检测，结果显示所有阳性克隆都能通过对ADE2、HIS3和LacZ报告基因的回转验证。

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