实验原理

细菌双杂交系统是研究在大肠杆菌中蛋白质与蛋白质相互作用的方法。这个系统是建立在转录活化作用基础上的并且包括细菌中两种融合蛋白质的合成，这两种蛋白质的相互作用可以激活一个报告基因的转录。特异地，当与一种融合蛋白相互作用的伙伴与细菌RNA聚合酶的一个亚单位融合时，这种融合蛋白就可以行使一个转录激活子的功能。这种细菌双杂交系统已经被用来研究从原核生物到真核生物的许多相互作用的蛋白质，也可以用来寻找复合物蛋白质文库中的相互作用的蛋白质。

图1细菌双杂交系统原理。 分别融合到a- NTD和λcI的蛋白质结构域X和Y之间的接触激活检测启动子引起的转录。β、β'和σ⁷⁰是大肠杆菌RNAP的亚单位。图示的检测启动子placO_R2- 62包含一个λ操纵子(O_R2)，它定位在lac核心启动子的转录起始点上游62bp处。组成lac核心启动子的- 10和-35元件，是RNAP结合的部位，这两个元件被称为小黑盒子。在报告细菌株US3F'3.1和细菌匹配报告细菌株中，检测启动子像图中所示的那样能够启动bla和lacZ报告基因的表达。

这里所说的细菌双杂交系统是基于以下原理:任何两个蛋白质间足够强的相互作用都可以激活大肠杆菌中的转录，只要相互作用蛋白质中的一个通过DNA结合区域结合到DNA上而另一个结合在细菌RNA聚合酶(RNA polymerase, RNAP)的一个亚单位上。通过这个系统，待检测的蛋白质结构域(诱饵)被融合到一个序列特异的DNA结合蛋白质上，另一个待研究的蛋白质(猎物)融合到细菌RNAP的一个亚单位上。我们用的经典的DNA结合蛋白质是从λ细菌噬菌体得来的CⅠ蛋白质(λcⅠ) ，而我们用的细菌RNAP亚单位是α亚单位。同样也可以用其他的DNA结合蛋白质和RNAP亚单位。分别指导λcⅠ和a融合蛋白质合成的两个质粒共同导人一个合适的大肠杆菌株中，其中包含一个启动相连报告基因表达的检测启动子。这个系统中所用的检测启动子在其上游调控区包含一个λcⅠ结合位点(OR2) (图1)。当诱导后，λcⅠ 融合基因的表达导致相应的λcⅠ融合蛋白与OR2结合。α融合基因的表达导致所产生的α融合蛋白聚集在RNAP上。结合在DNA上的λcⅠ融合蛋白和聚集在RNAP上的α融合蛋白的相互作用稳定了RNAP与检测启动子的结合，从而激活报告基因的转录(图1)。这两个融合蛋白相互作用的强度(人工激活子和它的人工活化的靶)在一定程度上决定了报告基因活化的程度。

为了便于使用这个细菌双杂交系统，可以用两种报告基因:编码β -内酰胺酶的bla,编码β -半乳糖苷酶的lacZ。在含有这两种报告基因的细胞中，检测启动子引起的转录导致了bla和lacZ基因的共表达(图1)。bla 基因对羧苄青霉素有耐受性，lacZ 基因的表达可以通过两种方法检测:以液体β-半乳糖苷酶实验进行定量检测，或检测含有显色底物X- gal (5- bromo-4 - chloro一3 -indolyl - β- D - thiogalactopyranoside)的指示培养基上的菌落颜色进行定性分析。本系统中应用可选择的报告基因如bla,有利于筛选复合物蛋白质文库中相互作用的蛋白质。

材料

2.1 制备λcI融合体

1.质粒pBT和pACλcI32可以用来制备融合λcI C -末端的融合体(见表1)。

2.感受态细胞(见注释4中关于化学方法制备感受态细胞的内容):细菌株XL1-Blue、XL1-BlueMRF'Kan和JM109可以用来扩增质粒pBT和pACXcI32 (见表2)。

3.抗生素贮存液:溶于50%乙醇的100mg/ml羧苄青霉素;溶于甲醇的25mg/ml氯霉素;溶于蒸馏水的50mg/ml卡那霉素，过滤除菌;溶于甲醇的10mg/ml四环素。抗生素贮存液保存在- 20°C。

4. Luria-Bertani (LB)琼脂板(包含适当的抗生素): 10g细菌用胰蛋白胨、5g 酵母提取物、10g NaCl、15g 细菌用琼脂溶于1L蒸馏水。高压蒸汽灭菌LB-琼脂。当培养基温度降到50°C以下时加抗生素。LB -琼脂板4℃保存。

5. LB: 10g细菌用胰蛋白胨、5g酵母提取物、10g NaCl溶于1L蒸馏水。高压蒸汽灭菌。室温保存。

表1 细菌双杂交系统中使用的质粒
质粒	概述	抗性	可用克隆位点	来源/参考文献
pBT	诱饵质粒,编码λcⅠ	氯霉素(25μg/ ml)	NotⅠ ,EcoRⅠ，SmaⅠ，BamHⅠ，XhoⅠ ,Bgl Ⅱ	Stratagene
pBT-LGF2	阳性对照质粒，编码λcⅠ-Gal4融合蛋白	氯霉素(25μg/ ml)		Stratagene
pACλcⅠ32	诱饵质粒，编码λcⅠ	氯霉素(25μg/ ml)	NotⅠ ,Bgl Ⅱ(BstY Ⅰ),AscⅠ，BstY Ⅰ	3
pTRG	猎物质粒，编码α-NTD	四环素(10µg/ml)	BamHⅠ,NotⅠ, EcoRⅠ ,XhoⅠ, SpeⅠ	Stratagene
pTRG-GalllP	阳性对照质粒， 编码α-GalllP融合蛋白	四环素(10µg/ml)		Stratagene
pBRSTAR	猎物质粒，编码α-NTD	四环素(10µg/ml)	BamHⅠ,NotⅠ	16
pBRαLN	猎物质粒，编码α-NTD	狻节青霉素(50µg/ml)	BamHⅠ,NotⅠ	3
pBRα-GalllP	阳性对照质粒，编码 α-GalllP融合蛋白	狻节青霉素(50µg/ml)		8

2.2 制备大肠杆菌RNA聚合酶α亚单位的融合体

1.质粒pTRG、pBRSTAR,和pBRαLN可以用来制备含大肠杆 菌RNA聚合酶α亚单位的融合体（见表1）。

2.感受态细胞：细菌株XLl-Blue MRF'Kan和JM109可用来扩增质粒pTRG和pBRSTAR,而细菌株XLl-Blue、XLl-Blue MRF＇Kan和JM109可用来扩增质粒pBRαLN(见表2)。

3.抗生素贮存液。

4.含适当抗生素的LB-琼脂板。

5.LB。

表2 细菌双杂交中使用的菌株
菌株	相关的基因型	抗性	报告基因	来源/参考文献
KSl	F'lacⅠq	卡那霉素(50μg/ ml)	lacZ
BacterioMatch Reportera	recA, F'lacⅠq	卡那霉素(50μg/ ml)	bla,lacZ	Stratagene
US3F'3.1	recA, F'lacⅠq	卡那霉素(50μg/ ml)	bla,lacZ
XLl-Blueb	recA, F'lacⅠq	四环素(10µg/ml)		Stratagene
XLl-Blue MRF'Kanb	recA, F'lacⅠq	卡那霉素(50μg/ ml)		Stratagene
JM109	recA, F'lacⅠq

a.该菌株比US3F'3.l菌株具有更高的转化效率。

b.在细菌双杂交系统中使用该菌株来扩增质粒。

2.3 检测蛋白质－蛋白质相互作用

2.3.1 含有诱饵和猎物质粒的报告菌株的快速转化步骤

1.报告菌株KSl或者细菌匹配报告菌株的感受态细胞。

2.含适当抗生素的LB-琼脂板。

3.抗生素贮存溶液。

2.3.2 在液体培养物中定量分析报告基因的表达：p-半乳糖苷酶实验

1.LB。

2.抗生素贮存溶液。

3.IPTG贮存液(100mmol/L):溶解0.238g异丙基-β-D-硫代半乳糖甘酶(IPTG)到10ml蒸熘水中，过滤除菌，分装，贮存在一20°C。

4.Z-缓冲液：16.lg Na₂HPO₄·7H₂O, 5.5g NaH₂PO₄, 0.75g KCI, 0.246g MgSO₄•7H₂O，2.7mlβ-巯基乙醇，蒸熘水定容到1L。调整pH值到7.0。不需高压蒸汽灭菌。

5. 0.1%SDS。

6.氯仿。

7. ONPG溶液：0-硝基苯基-β-D-半乳糖苷酶(ONPG;4mg/ml)溶千Z缓冲液。贮存在一20°C。

8.lmol/L Na₂CO₃ 。

2.4大肠杆菌中蛋白质相互作用伙伴的筛选文库

1.抗生素贮存溶液。

2.X-gal贮存溶液：溶于二甲基甲酰胺的l0mg/mlX -gal。

3.150mm LB-琼脂板包含50µg/ml卡那霉素，10µg/ml四环素，25µg/ml氯霉素，20µmol/L IPTG, 500-2000µg/ml羧苄青霉素。

4.100mm LB-琼脂板包含50µg/ml卡那霉素，10µg/ml四环素，25µg/ml 氯霉素，20µmol/L IPTG, 500-2000µg/ml羧苄青霉素。

5.LB。

6.IPTG。

三、方法

3.1制备λcⅠ融合体

质粒 pBT 和 pACλcⅠ32可以用来制备与λcⅠ C-末端融合的融 合蛋白。 这些相关质粒衍生千低拷贝数量的 pACYC184 载体并对氯霉素 (25µg/ml) 有耐受性。 在所有这些质粒中λcⅠ 融合基因的表达是由 lacUV5 启动子调控的并且由 IPTG 诱导。 在没有 IPTG存在时，λcⅠ 融合基因的表达可以被Lac抑制子（由 lacⅠ 基因编码）抑制。 质粒 pBT 和 pAC λcⅠ32 的多克隆位点不同，多克隆位点被引入到cⅠ基因的末端（以促进诱饵蛋白质融合到λcⅠ 的 C-末端:见表1) 。诱饵（感兴趣的蛋白质或结构域）可以通过以下方法融合到λcⅠ的C-末端：将一个适当的设计好的 PCR 产物克隆到 pBT 或 pAC λcⅠ32, 这样编码诱饵的基因就与cⅠ编码区在同一个阅读框中。质粒 pBT 和 pAC λcⅠ32 包含 lacUV5启动子，因此它们只能在含有如千的大肠杆菌株如 XLl - Blue、 XLl - Blue MRF'Kan 和 JM109 中繁殖 。 因为这些质粒的拷贝数较低，所以当需要分离质粒 DNA 的时候就需要较多的培养物。 诱饵质粒应该用标准分子生物学程序及2.1所列的材料来构建。

3.2制备大肠杆菌RNA聚合酶α亚单位的融合体

质粒 pTRG、 pBRSTAR 和 pBRαLN可以用来制备大肠杆菌RNA 聚合酶 α 亚单位 N-末端结构域的融合体 (α-NTD)。融合实际上是对α连接子C-末端的融合；α连接子长且柔韧，正常时连接α亚单位的N-和C-末端结构域。质粒pTRG、pBRSTAR和pBRαLN衍生于低拷贝数目的质粒pBR322并且包含了一个去掉顶端的ropA基因（编码RNAP α亚单位的1-248位氨基酸，即α-NTD和连接子），此基因的启动子为串联的lpp(一个强的组成性表达的启动子）和lacUV5启动子。质粒pTRG和pBRSTAR对四环素(10ug/ml)有耐受性，而质粒pBRαLN对羧苄青霉素（或氨苄青霉素）(50-100ug/ml)有耐受性。质粒pTRG和pBRSTAR的多克隆位点不同，多克隆位点被引入到去掉顶端的ropA基因的末端以促进猎物蛋白质融合到α连接子的末端（见表1)。猎物可以通过以下方法融合到α连接子的C-末端：将一个设计合理的PCR产物克隆到这些质粒中，这样编码猎物的基因就到rpoA编码区的阅读框中了。质粒pTRG、pBRSTAR和pBRαLN含有lacUV5启动子，所以只会在含有lacⅠ^a的大肠杆菌中才会扩增。质粒pBRαLN可以在细菌株XLl-Blue MRF'Kan和JM109中繁殖（但不能在XLl-Blue 中扩增是因为这种细菌株在F'游离基因已经携带了一个耐受四环素的决定子）。猎物质粒应该用标准分子生物学程序和副标题2.2所列的材料来构建。

3.3检测蛋白质-蛋白质相互作用

为了检测两种蛋白质是否有相互作用，指导合成所需λcⅠ融合蛋白质的诱饵质粒和合成Q融合蛋白质的猎物质粒共转化进一个适当的大肠杆菌报告菌株，同样也转染进适当的对照。转染后的产物 检测β-半乳糖昔酶活性。只有在猎物蛋白质存在的条件下，诱饵蛋白质才能刺激β-半乳糖昔酶的产生，这样就说明这两种蛋白质是相互作用的。指导入cl-Gal4和α-GalllP融合蛋白质合成的质粒作为阳性对照（见表1)。前面已经提到过，λcⅠ-Gal4和a▪GalllP融合蛋白在大肠杆菌中可以相互作用并且能够在适当的报告菌株中强烈促进衍半乳糖昔酶的产生。适当的阴性对照包括： 与猎物质粒的母本载体一起转染的诱饵质粒，与诱饵质粒的母本载体质粒 (pBT 或 pACλcⅠ32)。另外还可选择以下阴性对照： 与指导合成 α- GalllP 融合蛋白的质粒一起转染的诱饵质粒，与指导合成λcⅠ- Gal4 融合蛋白的质粒一起转染的猎物质粒(pBT - LGF2)。

目前已经设计了多种不同的报告菌株用于这个细菌双杂交系统(见表2)。作者常规选用报告菌株KS1,它是大肠杆菌菌株MC1000的衍生物，它带有一个对卡那霉素有耐受性并且携带lacⅠ^q的F'游离基因。KS1染色体上还含有一个imm 21前噬菌体，它带有一个连接到检测启动子plac O^R2-62上的lacZ报告基因。这个检测启动子(图1所示)包含lac核心启动子，定位在lac转录起始点上游62bp的λ操纵子(O^R2)。 同样也可以选用报告菌株US3F'3.1和细菌匹配的报告菌株。这些报告菌株包含相同的F'游离基因，它含有在plac O^R2 - 62检测启动子控制下的bla和lacZ报告基因(见图1)。在这些菌株中，F'游离基因也含有lacⅠ^q和一个耐受卡那霉素表达盒(cassette)。 US3F'3.1 和细菌匹配的报告菌株与报告菌株KS1相比，前两者背景较低且未激活时lacZ表达水平较低(β -半乳糖苷酶活性大约15 Miller 单位，而后者β-半乳糖苷酶活性大约60 Miller单位)。另外，必须说明，用细菌匹配的报告菌株比用US3F'3.1菌株能得到更高的转染效率，推测可能是因为这两种菌株的基因型不同的缘故。

3.3.1用诱饵和猎物 质粒转化报告菌株的快速步骤

1.冰上融化报告菌株化学感受态细胞。

2.诱饵和猎物质粒或对照质粒各取约10ng加入到一个灭菌的1.5ml微离心管中，冰上放置5分钟。

3.每管中加人报告菌株化学感受态细胞(25ul) 。

4.冰上孵育10分钟，42℃热休克2分钟，冰上孵育2分钟。

5.把每种转染混合物涂在含有适当抗生素的LB琼脂板上。

6.琼脂板37°C过夜。

这个步骤不能引起抗生素耐药决定子的表达，因此不能得到特别高的转化效率。要得到较高的转化效率的转化程序。

3.3.2液体培养物中定量分析报告基因的表达: β-半乳糖苷酶实验

这个步骤最初由Miller设计。

1.转化板上的单个克隆(见3.3.1)接种到含有适当抗生素和浓度在0~200umol/L的IPTG的3ml LB中。

2.培养物通风条件下37°C过夜(大约16小时)。

3.每个过夜培养物各接种30μl到3ml LB中，LB与过夜培养物含同种同浓度的抗生素和IPTG。

4.通风条件下37°C孵育培养物直到培养物的OD₆₀₀达到0.3~0.7。

5.培养物冰上静置20分钟。

6.每管各取1ml细菌培养物转移到一个比色杯中测量OD₆₀₀。在这一步，如果需要可以取一部分细菌培养物做蛋白质印迹分析。

7.每种培养物各取200ul转移到一个小的玻璃检测管(实验管)，其中包含800ul Z缓冲液。这一步应该设置平行管，因此每种培养物需两个实验管。对照平行管在800ul Z缓冲液中各加200ul LB。

8.每个实验管中加人30ul 0.1%SDS。

9.每个实验管中加入60ul氯仿。

10.每个实验管旋涡震荡6秒。

11.将实验管和解冻的ONPG贮存液置于28℃水浴，孵育10分钟以平衡到28°C。

12.每个实验管加入200ul 4mg/ml的ONPG (平衡到28°C)启动实验，用计时器记录每个实验开始的时间。

13.摇动或轻柔旋涡震荡来混合实验管中的内容物。

14.当管变足够黄时加人500ul 1mol/L Na₂CO₃终止反应并记录每个实验结束的时间。

15.低速瞬时旋涡震荡实验管，室温或4℃放置直到反应完全。

16.从每个实验管中各取lml转移到一个比色杯，测定每个实验420nm和550nm的吸光度，用对照管作为空白。

17.每个实验的β -半乳糖苷酶活性(以Miller单位表示)用以下公式计算:

Units= 1000X[OD₄₂₀-(1.75XOD₅₀₀)/t X v X OD₆₀₀]

注:t是反应时间，单位为分钟，V是实验中所用的培养物体积，单位为ml(如0.2)，OD₆₀₀是每个实验中所用培养物的检测结果。

3.3.3 β-半乳糖苷酶实验的结果分析

诱饵和猎物蛋白质的相互作用，会引起高于阴性对照至少数倍的β-半乳糖苷酶活性增高。必须注意的是，阴性对照也会有一定量的β-半乳糖苷酶活性表达，反映的是检测启动子启动lacZ报告基因表达引起的背景转录水平。

3.4大肠杆菌中蛋白质相互作用伙伴的筛选文库

这里描述的细菌双杂交系统可以用来从只有一部分结合的诱饵和猎物蛋白质能发生相互作用的复合物文库中鉴定相互作用的诱饵和猎物蛋白质。重要的一点是，在含有连接到有活性的placOR2一62检测启动子的bla基因的报告菌株细胞中，诱饵和猎物蛋白质的相互作用会导致细胞对较高浓度的羧苄青霉素耐药。

将目的蛋白质(或结构域)融合到λcI蛋白质的C -末端以制备诱饵，如3.1中所描述。筛选文库以得到能与诱饵相互作用的蛋白质之前，必须要确认作为诱饵的λcI融合蛋白质可以与λ操纵子结合。可以用报告菌株S11 - LAM122]来检测，它带有一个F'游离基因，F'游离基因含有定位在一个相关的强检测启动子一10和一35元件之间的λ操纵子。这个在报告菌株中的检测启动子可以

启动相连的lacZ报告基因的表达，当λ操纵子被占位后它会受到抑制。在细菌株S11-LAM1中检测启动子被抑制的程度可以反映一个特定蛋白质结合λ操纵子的效率。任何与λ操纵子结合很弱或根本不结合的λcI融合蛋白质是不适合作为诱饵的。

另外，可以用免疫实验来证实λcⅠ融合蛋白质与λ操纵子的结合。因此，包含pBT质粒或编码λcⅠ融合蛋白质的pACλcⅠ32质粒的细胞应该对超感染λcⅠ噬菌体有免疫力，即使细胞在没有IPTG的条件下生长。这可以通过一一个简单的交叉划痕实验来检测。

a融合蛋白质文库(猎物文库)可以通过把基因组DNA、cDNA或PCR产物克隆进pTRG或pBRSTAR质粒来制备。然而，对于构建文库，本章不作介绍。特定的用pTRG制备的cDNA文库可以从Stratagene 购得。接下来介绍筛选一个用pTRG或pBRSTAR质粒制备的α融合蛋白质文库的步骤，以便得到与预定诱饵相互作用的蛋白质。

3.4.1文库筛选

1. 5ml灭菌微离心管中加人1μg诱饵质粒，冰上孵育5分钟。

2.加人100ul包含猎物文库的细菌匹配的报告菌株化学感受态细胞(克隆进pTRG或pBRSTAR)。

3.冰上孵育30分钟。42°C热休克2分钟，冰上静置至少2分钟。

4.向转染混合物中加人1ml LB，37°C孵育至少1小时。

5.向转染混合物中加人IPTG至终浓度10umol/L，37°C孵育1小时。

6.铺板:从有效转化混合物中取约10⁷转化体铺到包含50μg/ ml卡那霉素，10μg/ml 四环素，25μg/ml 氯霉素，20umol/LIPTG， 500~ 2000ug/ml羧苄青霉素，X- gal 的150mm LB琼脂板上。

7.平板37°C过夜。在这些筛选板上阳性克隆将形成蓝色克隆。

3.4.2分析假定的相互作用伙伴

筛选板上的蓝色克隆可能是假阳性(含有羧苄青霉素)，但是，不像真正的阳性克隆，假阳性克隆不含与融合蛋白质相互作用的质粒。为了去掉一类假阳性克隆，所有假定的阳性克隆可以被重新接种在100mm LB琼脂板上，平板含有50μg/ml卡那霉素、10μg/ml四环素、25μg/ml氯霉素、20umol/L IPTG (或最初筛选时所用的浓度)、羧苄青霉素(最初筛选时所用的浓度)、X - gal，真阳性克隆在这些板上应该再次产生蓝色克隆。通过这个检测得到的阳性克隆接种到5ml含有50ug/ml卡那霉素、10μg/ml 四环素的LB中，适当的生长温度(37°C或 30°C)通风条件下过夜。从过夜培养物中分离出质粒DNA然后转化大肠杆菌细菌株XL1-Blue MRF'Kan或JM109,于是目的猎物质粒(包含四环素耐药基因)就可以从诱饵质粒中游离并纯化(转化产物应该铺在含有10μg/ml四环素的LB琼脂板上)。一旦目的猎物质粒被分离出来，它就可以与最初的诱饵质粒一起转化进 一个适当的报告菌株，当然要有适当的对照(见3.3)。猎物质粒能否诱导与诱饵相互作用的α融合蛋白质的合成可以通过液体培养物的β-半乳糖苷酶实验进行定量评价(见3.3.2)或通过把转化产物铺到含有羧苄青霉素和X -gal的筛选板上进行定量分析(见3.4.1)。任何编码与诱饵相互作用的猎物的质粒可以被测序从而确定相互作用伙伴的身份。

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