实验原理：

裂解法抽提酵母质粒。

实验目的：

从酵母菌体中抽提酵母质粒，可用于转化大肠杆菌，便于后续测序验证等实验的开展。

试剂：

2×YPAD 液体培养基 配方如下：		Yeast lysis solution(YLS) 配方如下：
Yeast extract	4g (OXOID,LP0021)	2% (体积比)	Triton X-100
Glucose H2O	8.8g (国药集团化学试剂有限公司，10010518)	1% (质量体积比)	SDS (上海生工，SB0485)
Peptone	8g (OXOID,LP0042)	100mM	NaCL (上海生工，SB0476)
Adenie sulfate	20mg (上海生工，0183)	1mM	EDTA (国药集团化学试剂有限公司，10009717)
加ddH2O至200mL。 注：培养基灭菌前呈亮黄色，灭菌后呈葡萄糖酒红色。		例如： Triton X-100 2mL SDS 1g NaCl 0.585g EDTA(0.5M) 0.2mL 加ddH2O至100mL。 注：Triton X-100非常粘稠，吸取时需用剪过的枪头吸，枪头需在液面处停留较长时间待吸取充分后再取出。
3.25:24:1 （苯酚：三氯甲烷：异戊醇体积比）：上海生工，pH=8.0	4.95%乙醇 （国药试剂，分析纯）	5.3M NaAc （国药试剂，分析纯，pH=5.2）	6.75%乙醇 （由95%乙醇稀释）

仪器：

1.30℃恒温摇床。

2.移液器：1mL、200uL、10uL、2.5uL

3.枪头及配套枪头套：1mL、200uL、20uL

4.EP管和配套管架：1.5mL

5.4℃冷冻离心机

操作步骤：

1.挑取酵母单菌落接种于4mL 2xYPAD 液体培养基中，30℃ 220 rpm摇床培养约18h。

2.将培养好的菌液倒入1.5mL离心管中，室温（25℃）1000g离心10sec收集菌体（约100uL）。

3.向菌体沉淀中加入200uL YLP (Yeast lysis solution),加入牙签，在振荡器上涡旋打散混匀菌体。

4.向管中加入200uL苯酚：三氯甲烷：异戊醇(25:24:1)，颠倒摇晃5min，室温13000rpm离心5min。

5.小心吸取上清转移至新离心管中。

6.重复步骤4和步骤5。

7.向管中加入500uL 95%乙醇和20uL 3M NaAc(pH=5.2)，颠倒混匀。4℃ 10000g 冷冻离心10-30min。

8.向管中加入750uL 75%乙醇浸洗沉淀，室温10000g 离心 5-10min。

9.重复步骤8。

10.小心弃上清，将离心管置于超净工作台上吹干沉淀，加入10uL ddH₂O或TE熔解酵母质粒。

注意事项：

1.此方法抽提得到的酵母质粒可用于电转大肠杆菌。

2.酵母质粒拷贝数低，浓度低，所以需多取一些（1-2uL）电转大肠杆菌感受态细胞。

3.酵母质粒电转效率较低，所以加LB复苏后的菌液需全部涂LA平板。

4.电转大肠杆菌质粒时需用转化效率较高的感受态细胞。

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