文库建立和文库筛选
互作验证
1 载体构建
根据客户提供基因序列构建好的pBait-AbAi载体
2 pBait-AbAi质粒线性化
图1. pBait-AbAi BstBI酶切
Lane M:DNA Marker 1kb
Lane 1:酶切前p53-AbAi
Lane 2:酶切后p53-AbAi
Lane 3:酶切前pAbAi
Lane 4:酶切后pAbAi
Lane 5:酶切前pBait-AbAi
Lane 6:酶切后pBait-AbAi
由图1可知,p53-AbAi质粒、pAbAi质粒和pBait-AbAi质粒均已正确酶切开,可用于下步实验。
3 线性化pBait-AbAi质粒整合Y1HGold检测
图2.线性化pBait-AbAi整合Y1HGold后PCR鉴定
Lane M:DNA Marker 2000
Lane 1:p53-AbAi质粒
Lane 2,3:Y1HGold[p53-AbAi]
Lane 4:pAbAi质粒
Lane 5,6:Y1HGold[pAbAi]
Lane 7:pBait-AbAi质粒
Lane 8,9:Y1HGold[pBait-AbAi]
由图2可知,阳性菌株Y1HGold[p53-AbAi]菌落PCR鉴定条带与质粒p53-AbAi PCR鉴定条带大小一致,表明p53-AbAi已成功转入Y1HGold基因组中;阴性菌株Y1HGold[pAbAi]菌落PCR鉴定条带与质粒pAbAi PCR鉴定条带大小一致,表明pAbAi已成功转入Y1HGold基因组中;诱饵菌株Y1HGold[pBait-AbAi]菌落PCR鉴定条带与质粒pBait-AbAi鉴定条带大小一致,表明pBait-AbAi已成功转入Y1HGold基因组中。线性化pBait-AbAi整合Y1HGold后PCR产物测序结果见附件一。
4 自激活检测
注:AbA浓度分别为0,100,150,200,300,500,700,900 ng/ml
图3可以看出pBait-AbAi成功转入Y1HGold菌株中,且500 ng/ml AbA可以抑制背景菌生长,可以选择500 ng/ml AbA进行单杂筛库实验。
5 筛选结果
将Y1HGold[pBait-AbAi]与酵母单杂cDNA文库进行筛选,在SD/-Leu/AbA(500 ng/ml)筛选平板上共有个15阳性克隆生长,点板图片见下图。
6 一对一互作验证结果
Y1HGold[pBait-AbAi]进行一对一互作验证后,点板图片见下图
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