抗生素抗性基因检测服务

酵母单杂交技术服务

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酵母单杂交技术是由Li等从酵母双杂交技术发展而来的(1993年),是根据DNA结合蛋白(即转录因子)与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理,克隆与靶元件特异结合的转录因子基因的有效方法。

酵母单杂交原理

酵母单杂交流程



酵母单杂交流程

文库建立和文库筛选


验证


互作验证

互作验证


酵母单杂交服务项目

服务内容 客户需提供 交付结果 价格
文库筛选 1、诱饵基因序列或诱饵质粒
(pHis2-Bait或pAbAi-Bait);
2、文库质粒(不少于50ug AD文库质粒/每次筛库)
(客户最好能提供文库质检相关信息:如物种、库容、文库滴度、文库cDNA片段大概的大小等)
1、质粒在受体菌的阳性菌
2、提供详细的、完整的实验报告,清晰的实验图片
3、筛选结果的测序结果和质粒
在线询价
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蛋白-蛋白点对点互作验证 1、pHis2-Bait或pAbAi-Bait和AD-prey质粒
2、或者Bait和Prey序列,质粒由我们构建
1、提供详细的、完整的实验报告,清晰的实验图片
2、在受体菌的阳性菌
自激活和毒性验证 1、pHis2-Bait或pAbAi-Bait质粒
2、或者Bait序列,质粒由我们构建
酵母质粒提取和测序 酵母菌液或者具有菌斑的平板 1、提供详细的、完整的实验报告
2、筛选结果的测序结果和质粒

案例展示



1 载体构建

根据客户提供基因序列构建好的pBait-AbAi载体

2 pBait-AbAi质粒线性化

酵母单杂案例

图1. pBait-AbAi BstBI酶切
Lane M:DNA Marker 1kb
Lane 1:酶切前p53-AbAi
Lane 2:酶切后p53-AbAi
Lane 3:酶切前pAbAi
Lane 4:酶切后pAbAi
Lane 5:酶切前pBait-AbAi
Lane 6:酶切后pBait-AbAi

由图1可知,p53-AbAi质粒、pAbAi质粒和pBait-AbAi质粒均已正确酶切开,可用于下步实验。

3 线性化pBait-AbAi质粒整合Y1HGold检测

酵母单杂案例

图2.线性化pBait-AbAi整合Y1HGold后PCR鉴定
Lane M:DNA Marker 2000
Lane 1:p53-AbAi质粒
Lane 2,3:Y1HGold[p53-AbAi]
Lane 4:pAbAi质粒
Lane 5,6:Y1HGold[pAbAi]
Lane 7:pBait-AbAi质粒
Lane 8,9:Y1HGold[pBait-AbAi]

由图2可知,阳性菌株Y1HGold[p53-AbAi]菌落PCR鉴定条带与质粒p53-AbAi PCR鉴定条带大小一致,表明p53-AbAi已成功转入Y1HGold基因组中;阴性菌株Y1HGold[pAbAi]菌落PCR鉴定条带与质粒pAbAi PCR鉴定条带大小一致,表明pAbAi已成功转入Y1HGold基因组中;诱饵菌株Y1HGold[pBait-AbAi]菌落PCR鉴定条带与质粒pBait-AbAi鉴定条带大小一致,表明pBait-AbAi已成功转入Y1HGold基因组中。线性化pBait-AbAi整合Y1HGold后PCR产物测序结果见附件一。

4 自激活检测

酵母单杂案例

注:AbA浓度分别为0,100,150,200,300,500,700,900 ng/ml

图3可以看出pBait-AbAi成功转入Y1HGold菌株中,且500 ng/ml AbA可以抑制背景菌生长,可以选择500 ng/ml AbA进行单杂筛库实验。

5 筛选结果

将Y1HGold[pBait-AbAi]与酵母单杂cDNA文库进行筛选,在SD/-Leu/AbA(500 ng/ml)筛选平板上共有个15阳性克隆生长,点板图片见下图。

酵母单杂案例

6 一对一互作验证结果

Y1HGold[pBait-AbAi]进行一对一互作验证后,点板图片见下图

酵母单杂案例


部分客户发表文章:

1、WRKY46 promotes ammonium tolerance in Arabidopsis by repressing NUDX9 and IAAconjugating genes and by inhibiting NH4+efflux in the root elongation zone.DOI: 10.1038/s41438-020-0327-z(IF=8.55)

2、CsMYB60 directly and indirectly activates structural genes to promote the biosynthesis of flavonols and proanthocyanidins in cucumber.Hortic Res. doi: 10.1038/s41438-020-0327-z.(IF=5.4)

3、A WRKY transcription factor PbrWRKY53 from Pyrus betulaefolia is involved in drought tolerance and AsA accumulation.Plant Biotechnology Journal, 2019, 17:1770–1787.

酵母单杂交的应用:

• 确定已知DNA—蛋白质之间是否存在相互作用;
• 筛选结合于目的顺式调控元件或其他短DNA序列的新基因;
• 确定蛋白结合DNA的结构域,准确定位与DNA结合的蛋白序列。

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