酵母单杂交技术

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酵母单杂交体系是1993年由Wang和Reed创立的,该小组利用此技术从嗅觉上皮神经元中克隆得到了OLF-1转录因子的cDNA,自创立以来已经被广泛应用于各个研究领域中。传统的研究DNA与蛋白质之间相互作用的技术,需要分离纯化蛋白这个步骤。酵母单杂交体系可通过识别稳定结合于DNA上的蛋白质,从而直接从DNA文库中筛选与靶序列相互作用的蛋白编码的基因序列,不需要分离和纯化蛋白,克服了体内研究的局限性。酵母单杂交体系是在酵母双杂交体系基本原理的基础上,通过观察酵母细胞内报告基因的表达状况,在酵母细胞内研究DNA与蛋白质之间的相互作用的一种技术。许多真核生物的转录激活因子具有2个功能独立的结构域,即特异结合于顺式作用元件上的DNA结合结构域和发挥基因调控功能的DNA激活结构域,这两个结构域单独作用均不能启动下游报告基因的表达。酵母单杂交技术就是依据这个原理,通过构建可与转录激活结构域结合的蛋白,然后与特异的DNA序列相结合,进而启动下游报告基因的表达。目前酵母单杂交体系已被广泛应用于验证DNA与蛋白质的相互作用,寻找与目的DNA片段相互作用的蛋白质分子,由此找到了许多新的转录因子。

酵母单杂交技术的优势

①酵母单杂交技术简单易行,在这个过程中,可直接识别与顺式作用元件结合的蛋白质,也可以直接从文库中筛选到蛋白质的编码序列,而不需要分离纯化蛋白等操作步骤;

②另外酵母是真核生物的模式物种,在其体内进行研究更接近真核生物的基因表达调控情况;

③利用酵母单杂交技术检测到的与DNA相互作用的蛋白质处于自然构象,避免了体外研究中的不足。

酵母单杂交技术的应用

目前酵母单杂交体系在动物基因工程、植物基因工程、医学和药学等领域 得到广泛应用。在DNA与蛋白质相互作用研究中的应用主要体现在以下几个 方面:

①鉴定已知DNA和已知蛋白质之间是否存在相互作用;

②分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点的新蛋白质;

③准确定位已经证实的具有相互作用的DNA结合位点和对蛋白质的DNA结合结构域进行分析。

自第一个转录因子OLF-1被克隆以来,利用酵母单杂交技术已经克隆鉴定了许多转录因子。但酵母单杂交技术也存在一定的局限性,比如酵母缺乏某些高等真核生物所特有的修饰过程,所以在这样的真核生物中研究DNA与蛋白质 的相互作用时必须经过体外的验证,比如bifcpull downco-ip等;酵母单杂交技术可能会造成假阳性和假阴性结果,比如有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用,或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录,因而造成假阳性的结果;酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性或者在宿主细胞内不能稳定的表达,甚至发生错误折叠,或者不能定位于酵母细胞核内等从而产生假阴性的结果。

酵母单杂交技术的基本原理

酵母单杂交基本原理图

图1 酵母单杂交基本原理图

酵母单杂交体系是依据酵母双杂交系统 的原理发展而来的,是在细胞内(in vivo)研究DNA与蛋白质之间相互作用 的技术。在酵母单杂交系统中,用特异的DNA序列取代了DNAGal4结合位 点,省略了酵母双杂交系统中采用的BD-X蛋白质杂交体。将已知的特定顺式 作用元件构建到最基本启动子(minimal promoter, Pmin)上游, 把报告基因 连接到Pmin下游,编码待测转录因子cDNA与已知酵母转录激活结构域融合 表达载体被转化进人酵母细胞,如转录因子能够和顺式作用元件结合(若连接 如3个以上顺式作用元件,可增强转录因子的识别和结合效率),就能激活 Pmin启动子,使报告基因得到表达(图1)。

酵母单杂交技术的实验过程包括酵母单杂交技术的实验过程包括:

①构建cDNA文库并插人到AD质粒载体的特定区域,成功构建融合表达载体。构建步骤为:样品总RNA的提取与mRNA的分离纯化,cDNA第一链、第二链的合成与分级分离,载体的制备,cDNA 双链与载体的连接,转化,转化子鉴定,原始文库的滴定及重组率计算。

②同时构建酵母报道子,即将已知的特定顺式作用元件按同一方向随机串联到基本启动子Pmin上游,并在其下游连上报告基因。

③然后对cDNA融合表达文库进行筛选,将酵母报道子、cDNA融合表达载体共转人酵母的感受态细胞中,进行筛选。

④最后对经过筛选得到的阳性克隆进行鉴定和测序分析,排除假阳性和假阴性克隆。

方法介绍:酵母单杂交技术

主要试剂
Trizol试剂盒 反转录试剂盒 DNATaq聚合酶 dNTP
DEPC水 胶回收试剂盒 PCR产物纯化试剂盒 pGADT7-Rec载体
pTMD-19T 酵母菌株AH109和Y187 限制性内切酶 T4 DNA连接酶
酵母质粒提取试剂盒等
主要仪器
微量移液器 PCR仪 凝胶成像仪 摇床
水浴锅 制冰机 低温离心机 台式离心机
垂直电泳槽 振荡器 半干转膜系统等

主要实验步骤

①cDNA AD融合表达文库的构建:首先对动物组织、植物组织或细胞等 进行处理,然后按照Trizol试剂盒说明书来提取这些样品的总RNA,最后溶 于DEPC处理水中备用,取一部分利用琼脂糖凝胶电泳对其完整性进行鉴定, 利用分光光度计对其浓度OD值(A260/A280 在1.9~2.0最佳)进行测定, 其他剩余的放-80°C备用;如果总RNA质量高,杂质少就采用Oligotex mRNA Kits法进行mRNA的分离纯化,反之则采用磁珠法进行;取分离得到酶在适当条件下合成cDNA第一链;冰浴终止反应,再加入第二链合成底物, RNaseH及DNA聚合酶I进行cDNA第二链合成;合成完毕后用PCR纯化 试剂盒进行纯化及末端被磷酸化;经过琼脂糖凝胶电泳进行胶回收,然后根据 载体和cDNA的电泳定量结果,每个样品设置几个比例将DNA与线性化的 pGADT7-Rec载体进行连接,然后经过转化,再利用PCR和质粒对转化子进行鉴定,对构建好的文库进行重组率测定。

注意事项:某些特定的不表达的基因,对于其转录因子的克隆,提取 RNA时需要将样品进行一定处理,比如应激或低温胁迫等;RNA提取过程中 注意整个过程均要戴手套。

②酵母报道子的构建:酵母报道子的构建是利用酵母单杂交技术筛选 cDNA融合表达文库的关键,目前构建酵母报道子的方法主要是随机串联和同 尾酶定向克隆方法。下面主要介绍下随机串联方法,包括顺式元件重复序列的 构建和表达载体的构建两部分。首先利用软件设计并合成带有与pAbAi载体 相同的酶切位点的上游和下游引物,通过PCR从启动子中扩增出含有顺式元 件的DNA片段,然后酶切这个DNA片段,在用T4连接酶连接上述DNA片 段,这时可形成重复的顺式元件片段。将连接后的重复顺式元件片段与原核表 达载体相连接,然后测序确定含有的重复顺式元件,然后酶切,再将这个顺式 元件的重复片段从原核载体上切除。将构建好的顺式元件的串联序列克隆在含 有基本启动子的表达载体pAbAi上,pAbAi 载体下游带有报告基因,将这个 重组载体按照公司的试剂盒说明书操作步骤转化人酵母细胞中,在选择培养基 上获得含有“顺式元件Pmin-报告基因”的酵母转化子,即把上述的酵母转化 子涂在SD选择性培养基地琼脂平板上,3~5d后挑取单克隆,用Mathmaker InserCheckPCR进行阳性克隆检测,同时设立阴性对照。

③cDNA融合表达文库的筛选:将前述制备的文库cDNA与线性化文库 载体连接后共同转化人诱饵酵母菌然后以不同稀释倍数涂在SD选择性培养基 的琼脂平板上,3~5d后挑取单克隆,计数平板上的克隆数量,并利用公式进 行计算文库筛选效率:筛选克隆数= [克隆数/ml] X [稀释倍数] X [重悬体积]。

④阳性克隆的鉴定与阳性cDNA质粒的分离获取:对,上步所筛选出的阳 性克隆,通过重新划线培养,进而首先从表型上进行确认;然后按照 Matchmaker Insert Check PCR Mix 2试剂盒说明书进行酵母克隆PCR,然后 对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析,如果大量克隆含有同一插入片段,则 在另取些克隆进行PCR分析,也可同时对PCR纯化产物进行测序验证。因转 化的酵母细胞中可含多种相关质粒,因此需要将酵母文库质粒分开,通过重复涂布的方式将含有不表达相互作用蛋白的cDNA质粒分离出去;按照Easy Yeast Plasmid Isolation Kit试剂盒说明书提取酵母中的阳性质粒,转化大肠杆 菌并分离出来,然后送交生物技术公司进行测序,测序结果正确后对其进行生 物信息学的初步分析,并利用RT-PCR技术扩增该目的蛋白基因。

注意:酵母单杂交实验中选择重组质粒的阳性克隆是关键点,因此需要对阳性克隆进行筛选和鉴定。


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