酵母单杂交实验流程

  ◎当前位置:首页>>技术服务>>酵母单杂交技术服务>>酵母单杂交实验流程

本文详细介绍了酵母单杂交的实验流程,包括实验原理、所需试剂材料、详细的实验步骤、以及酵母单杂交注意事项。

实验原理:

真核生物基因的转录起始需转录因子参与,转录因子通常由DNA结合结构域(ONA- binding domain, BD)和转录激活结构域(acivationdomain, AD)组成.用于酵母单杂交系统的酵母GAL4蛋白是一种典型的转录因子,GAL4的DNA结合结构域靠近羧基端,含有几个锌指结构,可激活酵母半乳糖苷酶的上游激活位点(UAS),而转录激活结构域可与RNA聚合酶或转录因子FIID相互作用,提高RNA聚合酶的活性。在这一过程中,DNA结合结构域和转录激活结构域可完全独立地发挥作用。在GAL4系统中构建与基因的ORFs融合的激活结构域GAL4-AD的特异载体,顺式作用元件与GAL4的DNA结合结构域GAL4-BD融合构建载体,分别转化酵母细胞。在酵母内表达的蛋白若与顺式作用元件发生相互作用时,就会将GAL4-BD和GAL4-AD结合在一起, 从而与上游激活序列(upstream activatingsequence, UAS)结合,激活相应报告基因的表达,在相应的营养缺陷型培养基上筛选阳性。

基因转录实际上是转录调控因子和启动子区各种顺式作用元件相互作用的结果,这种结合犹如蛋白质与蛋白质的互作一样具有特异性, 这是研究顺式作用元件即DNA序列与蛋白质互作的基础(如下图)。

酵母单杂交实验流程

实验目的:

确定已知DNA-蛋白质之间是否存在相互作用;分离结合于目的顺式调控元件或其他短DNA结合位点蛋白的新基因;定位已经证实的具有相互作用的DNA结合蛋白的DNA结合结构域,以及准确定位与DNA结合的核苷酸序列。

试剂准备:

培养基
2xYPAD SC-Leu/-Trp(SC-2) SC/—Ade/—His/—Leu/—Trp (SC-4)
Yeast extract 5g Yeast nitrogen base 1.675g Yeast nitrogen base 1.675 g
Peptone 10g -leu/-trp DO 0.17 g —Ade/—His/—Leu/—Trp DO 0.17 g
Glucose 11g Glucose 5.5g Glucose 5.5g
adenine hemisulphate 25 mg Add ddH20 to 250 ml Add ddH20 to 250 ml
Add ddH20 to 250 ml agar (add for solid medium) 5g/250ml agar (add for solid medium) 5g/250 ml
agar (add for solidmedium) 5g/250 ml 以上培养基用1M KOH调PH约至6.0

实验步骤:

1.构建载体目的基因融合连入pGADT7-Rec2(AD); 顺式作用元件连入pHis2或pHis2.1载体(顺式元件可以只连接一个拷贝, 也可以连接3个串联的并测序确认无误)。

2.验证两载体分别于对应的空载体共转时,有无激活转录报告基因情况,大多酵母苗株有毒性。只有确定无毒无自激活情况继续下面实验。

3.制备AH109酵母感受态细胞。

4.准备SCLeul-Trp (SC-2)培养基平板1 个(涂皿前应在超净工作台上吹20小时) 。

5.两个载体用酵母快速转化法,共转化进入AH109酵母感受态细胞。

6.涂皿,用刮铲涂皿至无流动菌液。

7.30℃恒温生长箱生长3-4天,挑单克隆。同时准备阴性及阳性对照。

8.准备SC/-Ade/-His/-Leu/-Trp (SC-4)培养基平板,(打点前应在超净工作台上吹2-3小时),底部用记号笔画好方格。

9.打点,在200ul无菌的PCR管中加入3μl无菌水,用小枪头取一点菌体,至无菌水中用移液器打散,在取出垂直点入方格中央。打点完毕吹干后,封固,30恒温生长箱生长2-3天。

10.阳性对照可以在SC-4培养基平板上生长,阴性对照不能生长,自己试验菌落如果生长的为阳性即互作,不能生长的为阴性即不互作。

注意事项:

(1)打点时小心,勿戳破培养基。

(2)有时由于插入的靶元件与酵母内源转录激活因子可能发生相互作用,或插入的靶元件不需要转录激活因子就可以激活报告基因的转录,因此往往产生假阳性结果。

(3)如果酵母表达的AD融合蛋白对细胞有毒性,或融合蛋白在宿主细胞内不能稳定地表达,或融合蛋白发生错误折叠,或者不能定位于酵母细胞核内,以及融合的Gal4AD封闭了蛋白质上与DNA相互作用的位点,则都可能干扰AD触合蛋白结合于靶元件的能力,从而产生假阴性结果。

以上就是我们对于酵母单杂交实验流程的总结,仅供参考。

 

您可能对以下内容感兴趣:
    酵母单杂交技术服务    DAP-seq    蛋白表达服务

 

酵母双杂