毕赤酵母蛋白表达服务实验报告案例

一、实验设计

    依据客户提供的蛋白序列，优化密码子使之更适宜在毕赤酵母中表达，采用全基因合成的方法合成基因XXX，经目的基因亚克隆至pYE-GAPα载体的多克隆位点区域，N端携带6XHis标签蛋白，获得的质粒经酶切及测序验证无误后，中抽质粒利用AVr II线性化重组质粒pYE-GAPα-XXX，电转化毕赤酵母SMD1168菌株，挑选5-10株阳性克隆，并通过PCR验证，选择3-5株阳性菌株进行表达，通过Dot-Blot验证其表达情况，定株后选用1株放大培养。按照实验预期：细胞培养过程中，XXX-His蛋白将会分泌表达至培养基中，通过SDS-PAGE电泳检测及WB验证目的蛋白的表达情况，通过Ni柱的亲和纯化，获得XXX-His蛋白。

二、试剂和耗材

名称	公司	名称	公司
pYE-GAPα-XXX质粒、DH5α 菌株、SMD1168或X33、Protein Marker、鼠抗His单抗、兔抗鼠HRP二抗、Ni2+IDA亲和层析胶	钟鼎实验保存	PVDF膜	美国Millipore公司
X光片	美国柯达公司	ECL显色液	中国普利莱公司
Acr、Bis、Tris	Sigma公司	SDS	Amresco公司
Tyrptone、Yeast Extract	OXOID公司	PCR反应管	Fisher公司
0.22 μm无菌滤器和透析袋	Millipore公司	Agarose	上海基因公司
DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒	AXYGEN公司	SAC I	宝生物

 

培养基配方如下：
LB培养基：胰蛋白陈1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%,琼脂粉1.5%(固体用)、NaOH调PH至7.4。
Low-Satl LB培养基：胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠0.5%、琼脂粉1.5%(固体用)、Na0H调pH至7.4。
YPD培养基： 胰蛋白胨2%、酵母提取物1%、葡萄糖2%(过滤除菌)、琼脂粉1.5%(固体用)。
YPDS培养基：胰蛋白胨2%、酵母提取物1%、葡萄糖2%(过滤除菌)、0.1mol/L山梨醇、琼脂粉1.5%(固体用)。

三、主要实验仪器

仪器名称	公司	仪器名称	公司	仪器名称	公司
Allegra 21R 台式高速冷冻离心机	美国BECKMAN公司	台式高速离心机	德国SORVAL公司	Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统	美国BIO-RAD公司
PTC-200基因扩增仪	美国MJ Research公司	320-S pH计	美国Mettler Toledo公司	AR5120电子天平	美国AHOM S公司
MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪	美国Amersham Pharmacia公司	雪花状制冰机	日本SANYO公司	JY92-2D超声波细胞粉碎机	中国新芝科器研究所
蛋白核酸检测仪	南京大学普阳科学仪器厂	Gene Pulser Xcell 电穿孔系统	美国BIO-RAD	NANODROP2000	美国Thermo公司

 

四、实验方法及结果

1、pYE-GAPα-XXX质粒构建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因，双酶切连接pYE-GAPα-XXX的EcoR I和Not I；挑取阳性克隆子测序，测序结果如下所示，单划线区域为该基因区域，其中红色字体为6xHis标签，蓝色字体为EK酶切位点。
C T A G T A T C A G A T G A G A T T T C C T T C A T T T T T A C T G C T G T T T T A T T C G C A G C A T C C T C C G C A T T A G C T G C T C C A G T C A A C A C T A C A A C A G A A G A T G A A A C G G C A C A A A T T C C G G C T G A A G C T G T C A T C G G T T A C T C A G A T T T A G A A G G G G A T T T C G A T G T T G C T G T T T T G C C A T T T T C C A A C A G C A C A A A T A A C G G G T T A T T G T T T A T A A A T A C T A C T A T T G C C A G C A T T G C T G C T A A A G A A G A A G G G G T A T C T C T C G A G A A A A G A G A G G C T G A A G C T G A A T T C G A A T T C C A C C A C C A C C A C C A C C A C G A C G A C G A C G A T A A A a t g G T C A C G T T A C C A T C A T T T A A C G A C C A T T C C T T T G T T A A T N N N N N N N N N N N N N N N N N N N -----涉及客户研究内容，不予显示---- N N N N N N N N N N N N N N N N N T A A G C G G C C G C C A G C T T T C T A G A A C A A A A A C T C A T C T C A G A A G A G G A T C T G A A T A G C G C C G T C G A C C A T C A T C A T C A T C A T C A T T G A G T T T G T A G C C T T A G A C A T G A C T G T T C C T C A G T T C A A G T T G G G C A C T T A C G A G A A G A C C C G G T C C T G C A G T T A A T T

使用Chromas软件查看测序峰图文件，截取部分序列示例如下：

测序拼接序列与理论序列相比对，结果显示获得序列与理论序列100%匹配，比对文件截图如下所示：

pYE-GAPα-XXX质粒酶切图与载体构建示意图如下所示：

翻译后蛋白序列如下，分子量为XXX KD（包含His标签），PI 5.03：
E F H H H H H H D D D D K V T N N N N N N N N N N N -----涉及客户研究内容，省略----- N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Q P Y

2、pYE-GAPα-XXX质粒线性化

抽提质粒10ug左右，使用AVr II线性化，冻干浓缩待用。

成份	AvrII	Buffer	质粒DNA	水
体积	10 ul	20 ul	10 ug	up to 100ul

酶切温度为 37℃，水浴 3h，1%琼脂糖凝胶电泳检测

3、酵母感受态细胞制备：

1、取100ul菌液，接入到装有10 mL YPD液体培养基试管中，30℃，280 rpm过夜培养。
2、将3mL过夜培养液接入到50mLYPD液体培养基的三角瓶中，30℃，280 rpm培养至OD值1.3-1.5之间，待用。
3、在无菌操作台内将上述菌液倒入到灭过菌的离心管中，5000rpm、4°C离心5min，弃上清，用50 mL冰浴无菌水重悬菌体。
4、5000rpm、4°C离心5min，弃上清，用25 mL冰浴无菌水重悬菌体。
5、5000rpm、4°C离心5min，弃上清，用10 mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬菌体。
6、5000rpm、4°C离心5min，弃上清，用400uL冰浴的1M山梨醇溶液重悬菌体。
最终得到500ul毕赤酵母感受态细胞，分装成80Ul/管备用，感受态细胞一般现做现用以确保电转效率更高。

4、电转酵母细胞

1、冰浴电转杯，将10uL线性化质粒pGAPZaA-0620加入到装有80uL毕赤酵母感受态酵母细胞的1.5mLEP管内，混匀后加入到直径为0.2 cm电转化杯中，将310uL等渗溶液加入到电转化杯中，然后把电转杯冰浴5min。
2、电击条件为：电压1700V、时间8mS、电击2次。
3、电击完成后，将1mL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里，用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中，30度静置培养2h。分别吸取50ul、100uL和200uL线性化质粒pGAPZaA-0620的混合液涂布于100ug/ml Zeocin抗生素YPD平板上，30度恒温培养48小时，待平板长出菌落，用接种环挑取平板上生长的单菌，将它接入到装有10ml YPD液体培养基试管中(抗生素Zeocin浓度100ug/ml)，30度，180rpm过夜培养。（高拷贝筛选需额外进行单独的实验操作，此处省略）

5、PCR鉴定阳性克隆菌株

挑选10株阳性克隆，分别提取基因组DNA，使用5’pGAP priming和 3’AOX1 priming引物PCR鉴定结果如下下图所示，结果显示均为阳性，按照预期，目标条带应该在1.5K左右。

6、小试表达

1、取上述鉴定阳性的表达菌株（1-10号菌株）分别接入装有9ml YPD（抗生素Zeocin 200ug/mL）的试管中，30度、220rpm培养24h
2、取24h培养菌种500uL接入到50ml YPD（抗生素Zeocin 200ug/mL）液体培养基中，30度、220rpm培养，48后h从培养基中取样，10000rpm、2min离心收集上清液
3、分别对10份菌株的表达上清使用Dot-Bot（anti-his抗体）检测，查看实验结果。（Dot-Blot实验结果案例见上页图5）
4、经过Dot-Blot实验分析，大部分克隆表达呈阳性，其中1号菌株阳性信号最强，使用1号菌株放大培养。

7、放大培养及纯化

1、挑选表达最明显的1号菌株放大至1L体系(YPD培养基 Zeocin 200ug/ml），30度、220rpm培养，72小时收集上清培养液。
2、72小时发酵液浓缩后以0.5 ml/min流速上样至利用低压层析系统，通过Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱。
3、用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
4、用Ni-IDA Washing Buffer(20 mM Tris-HCl，20 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速冲洗，至流出液OD280值到达基线；
5、用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl，250 mM咪唑，0.15 M NaCl，pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白，收集流出液；
6、将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中，使用PBS（PH7.4）进行透析过夜后进行SDS-PAGE分析。

8、蛋白质鉴定

对纯化后的蛋白，依据合同约定，进一步验证蛋白质的正确性，可选的方法有western blot， MS（分子量质谱），PFM(肽指纹图谱）具体的实验案例请参照对应的服务项目，此处省略。

补充说明：
依据我们的大量实践经验表明：利用酵母体系进行蛋白表达，蛋白表达成功率相对原核表达体系及偏低。在实验室的摇瓶状态下，受培养条件，特别是溶氧量的限制，很难实现高细胞密度培养，因此单位体积的产量偏低，很多时候甚至无法纯化或纯化成本极高，因此我们无法具体的承诺交付的蛋白量，最终会依据培养的体积来纯化并交付蛋白。另外，酵母分泌的蛋白经过高尔基体的细胞器的修饰，会有糖基化、二硫键、三级结构等，其表观分子量往往会稍微偏大于理论分子量。

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