毕赤酵母蛋白表达服务实验报告案例

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毕赤酵母蛋白表达服务实验报告案例

一、实验设计

  依据客户提供的蛋白序列,优化密码子使之更适宜在毕赤酵母中表达,采用全基因合成的方法合成基因XXX,经目的基因亚克隆至pYE-GAPα载体的多克隆位点区域,N端携带6XHis标签蛋白,获得的质粒经酶切及测序验证无误后,中抽质粒利用AVr II线性化重组质粒pYE-GAPα-XXX,电转化毕赤酵母SMD1168菌株,挑选5-10株阳性克隆,并通过PCR验证,选择3-5株阳性菌株进行表达,通过Dot-Blot验证其表达情况,定株后选用1株放大培养。按照实验预期:细胞培养过程中,XXX-His蛋白将会分泌表达至培养基中,通过SDS-PAGE电泳检测及WB验证目的蛋白的表达情况,通过Ni柱的亲和纯化,获得XXX-His蛋白。

二、试剂和耗材

pYE-GAPα-XXX质粒(钟鼎实验保存),DH5α 菌株(钟鼎生物保种),SMD1168或X33(购自life公司,钟鼎实验保存),Protein Marker(钟鼎生物自制),PVDF膜(购自美国Millipore公司),X光片(购自美国柯达公司),ECL显色液(购自中国普利莱公司),鼠抗His单抗(钟鼎生物实验室自制),兔抗鼠HRP二抗(钟鼎生物实验室自制),Acr、Bis、Tris等(购自Sigma公司),SDS(购自Amresco公司),Tyrptone、Yeast Extract(购自 OXOID公司),PCR反应管(购自Fisher公司),0.22 μm无菌滤器和透析袋(购自Millipore公司),Ni2+IDA亲和层析胶(zoonbio公司)Agarose(购自上海基因公司),DNA胶纯化试剂盒、质粒小提试剂盒(购自AXYGEN公司),SAC I(购自宝生物),常规生化试剂为国产分析纯。

培养基配方如下:
LB培养基:胰蛋白陈1%、酵母提取物0.5%、氯化钠1%,琼脂粉1.5%(固体用)、NaOH调PH至7.4。
Low-Satl LB培养基:胰蛋白胨1%、酵母提取物0.5%、氯化钠0.5%、琼脂粉1.5%(固体用)、Na0H调pH至7.4。
YPD培养基: 胰蛋白胨2%、酵母提取物1%、葡萄糖2%(过滤除菌)、琼脂粉1.5%(固体用)。
YPDS培养基:胰蛋白胨2%、酵母提取物1%、葡萄糖2%(过滤除菌)、0.1mol/L山梨醇、琼脂粉1.5%(固体用)。

三、主要实验仪器

Allegra 21R 台式高速冷冻离心机 (美国BECKMAN公司),台式高速离心机(德国SORVAL公司),Biologic LP层析系统、Mini Protean II垂直平板电泳系统、Gel Doc2000成像系统、水平电泳系统(美国BIO-RAD公司),PTC-200基因扩增仪(美国MJ Research公司)
320-S pH计(美国Mettler Toledo公嫁汉嫁汉就司),AR5120电子天平(美国AHOM S公司),MultiTemp III 恒温水浴锅、Hofer ΜV-25紫外透射仪(美国Amersham Pharmacia公司),雪花状制冰机(日本SANYO公司),JY92-2D超声波细胞粉碎机(中国新芝科器研究所),蛋白核酸检测仪(南京大学普阳科学仪器厂),Gene Pulser Xcell 电穿孔系统(美国BIO-RAD),超净工作台(中国苏净集团),NANODROP2000(美国Thermo公司)

四、实验方法及结果

1、pYE-GAPα-XXX质粒构建

采用基于PAS(PCR-based Accurate Synthesis)的方法合成基因,双酶切连接pYE-GAPα-XXX的EcoR I和Not I;挑取阳性克隆子测序,测序结果如下所示,单划线区域为该基因区域,其中红色字体为6xHis标签,蓝色字体为EK酶切位点。
C T A G T A T C A G A T G A G A T T T C C T T C A T T T T T A C T G C T G T T T T A T T C G C A G C A T C C T C C G C A T T A G C T G C T C C A G T C A A C A C T A C A A C A G A A G A T G A A A C G G C A C A A A T T C C G G C T G A A G C T G T C A T C G G T T A C T C A G A T T T A G A A G G G G A T T T C G A T G T T G C T G T T T T G C C A T T T T C C A A C A G C A C A A A T A A C G G G T T A T T G T T T A T A A A T A C T A C T A T T G C C A G C A T T G C T G C T A A A G A A G A A G G G G T A T C T C T C G A G A A A A G A G A G G C T G A A G C T G A A T T C G A A T T C C A C C A C C A C C A C C A C C A C G A C G A C G A C G A T A A A a t g G T C A C G T T A C C A T C A T T T A A C G A C C A T T C C T T T G T T A A T N N N N N N N N N N N N N N N N N N N -----涉及客户研究内容,不予显示---- N N N N N N N N N N N N N N N N N T A A G C G G C C G C C A G C T T T C T A G A A C A A A A A C T C A T C T C A G A A G A G G A T C T G A A T A G C G C C G T C G A C C A T C A T C A T C A T C A T C A T T G A G T T T G T A G C C T T A G A C A T G A C T G T T C C T C A G T T C A A G T T G G G C A C T T A C G A G A A G A C C C G G T C C T G C A G T T A A T T

使用Chromas软件查看测序峰图文件,截取部分序列示例如下:

测序峰图

测序拼接序列与理论序列相比对,结果显示获得序列与理论序列100%匹配,比对文件截图如下所示:

测序拼接序列与理论序列比对图

pYE-GAPα-XXX质粒酶切图与载体构建示意图如下所示:

pYE-GAPα-XXX质粒酶切图与载体构建示意图

翻译后蛋白序列如下,分子量为XXX KD(包含His标签),PI 5.03:
E F H H H H H H D D D D K V T N N N N N N N N N N N -----涉及客户研究内容,省略----- N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N N Q P Y

2、pYE-GAPα-XXX质粒线性化

抽提质粒10ug左右,使用AVr II线性化,冻干浓缩待用。

成份 AvrII Buffer 质粒DNA
体积 10 ul 20 ul 10 ug up to 100ul

酶切温度为 37℃,水浴 3h,1%琼脂糖凝胶电泳检测

凝胶电泳图

3、酵母感受态细胞制备:

1、取100ul菌液,接入到装有10 mL YPD液体培养基试管中,30℃,280 rpm过夜培养。
2、将3mL过夜培养液接入到50mLYPD液体培养基的三角瓶中,30℃,280 rpm培养至OD值1.3-1.5之间,待用。
3、在无菌操作台内将上述菌液倒入到灭过菌的离心管中,5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用50 mL冰浴无菌水重悬菌体。
4、5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用25 mL冰浴无菌水重悬菌体。
5、5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用10 mL冰浴的1M山梨醇溶液重悬菌体。
6、5000rpm、4°C离心5min,弃上清,用400uL冰浴的1M山梨醇溶液重悬菌体。
最终得到500ul毕赤酵母感受态细胞,分装成80Ul/管备用,感受态细胞一般现做现用以确保电转效率更高。

4、电转酵母细胞

1、冰浴电转杯,将10uL线性化质粒pGAPZaA-0620加入到装有80uL毕赤酵母感受态酵母细胞的1.5mLEP管内,混匀后加入到直径为0.2 cm电转化杯中,将310uL等渗溶液加入到电转化杯中,然后把电转杯冰浴5min。
2、电击条件为:电压1700V、时间8mS、电击2次。
3、电击完成后,将1mL冰上预冷的浓度为1M山梨醇溶液加入到电击转化杯里,用枪头轻轻地吹打溶液均匀。把电转杯中的全部液体转移到新的2ml EP管中,30度静置培养2h。分别吸取50ul、100uL和200uL线性化质粒pGAPZaA-0620的混合液涂布于100ug/ml Zeocin抗生素YPD平板上,30度恒温培养48小时,待平板长出菌落,用接种环挑取平板上生长的单菌,将它接入到装有10ml YPD液体培养基试管中(抗生素Zeocin浓度100ug/ml),30度,180rpm过夜培养。(高拷贝筛选需额外进行单独的实验操作,此处省略)

常规阳性克隆平板图及高拷贝阳性克隆平板图

5、PCR鉴定阳性克隆菌株

挑选10株阳性克隆,分别提取基因组DNA,使用5’pGAP priming和 3’AOX1 priming引物PCR鉴定结果如下下图所示,结果显示均为阳性,按照预期,目标条带应该在1.5K左右。

PCR跑胶图及Dot-Blot检测图

6、小试表达

1、取上述鉴定阳性的表达菌株(1-10号菌株)分别接入装有9ml YPD(抗生素Zeocin 200ug/mL)的试管中,30度、220rpm培养24h
2、取24h培养菌种500uL接入到50ml YPD(抗生素Zeocin 200ug/mL)液体培养基中,30度、220rpm培养,48后h从培养基中取样,10000rpm、2min离心收集上清液
3、分别对10份菌株的表达上清使用Dot-Bot(anti-his抗体)检测,查看实验结果。(Dot-Blot实验结果案例见上页图5)
4、经过Dot-Blot实验分析,大部分克隆表达呈阳性,其中1号菌株阳性信号最强,使用1号菌株放大培养。

7、放大培养及纯化

1、挑选表达最明显的1号菌株放大至1L体系(YPD培养基 Zeocin 200ug/ml),30度、220rpm培养,72小时收集上清培养液。
2、72小时发酵液浓缩后以0.5 ml/min流速上样至利用低压层析系统,通过Ni-IDA Binding-Buffer预平衡的Ni-IDA -Sepharose CL-6B亲和层析柱。
3、用Ni-IDA Binding-Buffer以0.5 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
4、用Ni-IDA Washing Buffer(20 mM Tris-HCl,20 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速冲洗,至流出液OD280值到达基线;
5、用Ni-IDA Elution-Buffer(20 mM Tris-HCl,250 mM咪唑,0.15 M NaCl,pH8.0)以1 ml/min流速洗脱目的蛋白,收集流出液;
6、将上述收集的蛋白溶液加入透析袋中,使用PBS(PH7.4)进行透析过夜后进行SDS-PAGE分析。

酵母系统蛋白纯化示例

8、蛋白质鉴定

对纯化后的蛋白,依据合同约定,进一步验证蛋白质的正确性,可选的方法有western blot, MS(分子量质谱),PFM(肽指纹图谱)具体的实验案例请参照对应的服务项目,此处省略。

补充说明:
依据我们的大量实践经验表明:利用酵母体系进行蛋白表达,蛋白表达成功率相对原核表达体系及偏低。在实验室的摇瓶状态下,受培养条件,特别是溶氧量的限制,很难实现高细胞密度培养,因此单位体积的产量偏低,很多时候甚至无法纯化或纯化成本极高,因此我们无法具体的承诺交付的蛋白量,最终会依据培养的体积来纯化并交付蛋白。另外,酵母分泌的蛋白经过高尔基体的细胞器的修饰,会有糖基化、二硫键、三级结构等,其表观分子量往往会稍微偏大于理论分子量。