western blot实验中，最常用的样品有三种，分别是蛋白质溶液、细胞裂解液和免疫沉淀蛋白，本文将介绍处理这三种样品的方法，以更好的用于western blot实验。

一、蛋白质溶液的制备

大多数蛋白质溶液可与样品缓冲液混合并直接用于免疫印迹。下述方法可用于细胞去污剂裂解液，柱层析洗脱液和大多数其他来源的抗原样品。

①蛋白质样品必须溶于与凝胶电泳系统相匹配的溶液中。对于Tris/Glycine SDS-聚丙烯酰胺凝胶，蛋白质溶液的pH值应接近中性，盐浓度应低于200mmol/L。否则必须用样品缓冲液进行大量稀释，且缓冲液中的其他成分对电泳没有影响。更换缓冲液的方法要适当，可通过透析或脱盐层析柱来更换缓冲液；

②样品中的蛋白质浓度不能超过凝胶系统的上样容量。上述2个变量的参考值将在以后的凝胶电泳中详述。根据经验每个泳道总蛋白量不能超过150μg（每个小胶泳道＜5μg）。

1.对照

免疫印迹从蛋白质溶液开始就需设置两组对照。对照包括含有待测抗原的阳性对照.样品和能与阴性对照抗体发生反应的阴性对照样品。阳性对照是含有已知的或标准量的 待测抗原的样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或已鉴定的细胞系。它可提示免疫印迹是否成功，并能对抗原的相对分子量进行精确比较;如果阳性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计出待测样品中抗原的含量。阴性对照给出的是待测样品的背景读数。

若要比较多个样品，则需考虑蛋白质祥品的标准化。例如，如果要比较不同细胞中的抗原水平， 就需对细胞数或总蛋白进行标化。如果是测定不同浓度的纯化蛋白，则- -般是标化总蛋白含量。然而. 对于柱层析分离的样品则需比较每一组分的总体积。样品中蛋白质的总量可用测定蛋白质依度的常用 方法进行测定。样品中若未加澳酚蓝，蛋白质较易定量。 并可节省祥品缓冲液。

2.准备工作

准备一个70℃的水浴箱。

3.需要的溶液

不含DTT的Laemmli样品缓冲液(2% SDS, 10%甘油，60mmol/L Tris, pH 6.8和0.01%溴酚蓝);1mol/L DTT (-20℃贮存)。

4.操作步骤

(1)将蛋白质溶液与样品缓冲液混合:Tris/Glycine SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (PAGE)的样品应用缓冲液的条件是: 2% SDS、100mmol/LDTT (取自- 20℃保存的 1mol/L贮存液，临用前加入)、60mmol/L Tris ( pH6.8)、0.01%溴酚蓝和10%甘 油。通常是从2倍或5倍的贮存液中取出适当量配成。

(2)样品置70C水浴加热至少5min。 至此，电泳样品已准备就绪。
样品既可立即使用也可冻存。- 20℃存放的样品可稳定保存数月。

二、细胞裂解液的制备

通常需对不同样品抗原的总量进行比较或确定样品中是否存在待测抗原。在此过程中，细胞、组织或其他样品均直接用样品缓冲液破碎，当样品中的染色体DNA被剪切 成短片段后，经适当处理即可用于特定的电泳系统。在本例中，样品是以适合于标准的Tris/Glycine SDS-PAGE

某些样品需经剪切处理染色体DNA降低其溶液黏度,最简便的方法是超声处理，用浸入式探头或杯型超声器均可。

1.对照

免疫印迹从细胞裂解液开始就须设置两组对照。包括含有已知抗原的阳性对照样品 和能与阴性对照抗体发生反应的细胞裂解物。阳性对照是含有已知的或标准量的待测抗 原样品，来源于细菌或杆状病海超常表达系统或已鉴定的细胞系。它可提示免疫印迹是 否成功，并能对抗原的相对分子量进行精确比较;如果阳性对照中抗原的量是已知的， 可粗略估计出待测样品中抗原的含量。

阴性对照给出的是非免疫抗体与待测样品的背景读数。若有可能，再设置一个不含 待测抗原的细胞裂解液对照( 例如来源于含无效基因的细胞)更利于解释结果。

若比较多个不同细胞祥品的抗原含量，则需考虑样品标化问题。 例如，若进行有意义的比较，需校正样品的总蛋白量，或校正细胞数。测定样晶中蛋白质浓度可用蛋白质定量的常用测定方法。样品中若未加溴酚蓝，蛋白质较易定量。并可节省样品缓冲液。

2.准备工作

准备一个70℃的水浴箱。

3.需要的溶液

不含DTT的Laemmli样品缓冲液(20% SDs, 10%甘油，60mmol/L Tris, pH 6.8和0.01%溴酚蓝);1mol/L DTT ( - 20℃贮存)。

4.特殊的设备

若选用酵母或细菌，则需一台超声装置。

5.操作步骤

(1)确定需进行裂解的样品体积。组织培养细胞(10⁹细胞)为1g加1ml裂解液。 称取足够量的组织或器官样品，1g加1ml裂解液。将细菌或酵母细胞离心沉淀，通过 与刻度试管比较，按其沉淀物体积加入裂解液。

(2)加入10倍体积的样品缓冲液，强力混匀。用于Tris/Gilycine SDS - PAGE的 1x样品缓冲液为: 2% SDS、100mmo/LDTT (取自- 20℃存放的1mol/L贮存液，临 用前加入)、60mmol/L Tris ( pH6.8)、0.01% 溴酚蓝和10%甘油。

(3)对于酵母或细菌，用超声装置裂解细胞。用样品缓冲液悬浮细胞，以最大的强度超声4次，每次15~ 30s。在每次超声步骤之间，将样品转置冰浴中15s 。

(4)样品置70℃水浴加热至少5min。

(5)10000g离心10min，取上清液，将其移入另一洁净试管中。

至此，电泳样品已准备就绪。
样品既可立即使用也可冻存。-20℃存放的样品可稳定保持数月。

三、免疫沉淀蛋白的制备

多数情况下，粗提样品无需进一步纯化即可直接进行凝胶电泳。但下述两种情况在western blot之前使用免疫沉淀制备蛋白的效果较好。一是对含量极稀少蛋白的检定。由于 适合凝胶电泳分辨的蛋白质总量有-定限度，通常不可能在凝胶中加入足够量的蛋白质 样品来检测含量极稀少的抗原。此时可采用标准的免疫沉淀技术纯化和浓缩待测蛋白。 由于在免疫沉淀中使用与免疫印迹特异性相同的抗体，因而大大扩展了免疫印迹的检测 范围。二是免疫沉淀可用来确定蛋白质与蛋白质之间的相互作用。此时，用于免疫沉淀 的抗体和免疫印迹的抗体分别针对复合物中的不同蛋白质。如果对该复合物的研究较充 分，并了解应选择用何种抗体时，这种方法就非常有用。为研究蛋白质与蛋白质之间的 相互作用提供了一个有效的方法。

1.对照

实验对照的设置应包括能与免疫抗体共沉淀的样品和能与非免疫抗体共沉淀的样 品。通过两者比较可以鉴别免疫抗体所识别的条带和非特异性的背景条带(如来自重链 的条带)。此外还应该包括含有已知的或标准量的待测抗原的阳性样品，阳性对照可以 是含有已知或标准量待测抗原的任何样品，来源于细菌或杆状病毒超常表达系统或来源 于已充分鉴定的细胞系。该样品不必经过免疫沉淀但应在邻近的胶道和其他样品同时上 样电泳。它可提示免疫印迹是否成功，并对抗原的相对分子质量进行精确比较。如果阳 性对照中抗原的量是已知的，可粗略估计待测样品中抗原的含量。 相互作用提供了一个有效的方法。

2.准备工作

准备一个70℃的水浴箱。

3.需要的溶液

不含DTT的Laemmli样品缓冲液(20% SDs, 10%甘油，60mmol/L Tris, pH 6.8和0.01%溴酚蓝);1mol/L DTT ( -20℃贮存)。

4.操作步骤

(1)将样品缓冲液加入吸附抗原和抗体，并经过洗涤的A蛋白或G蛋白微珠中。 使样品缓冲液和微珠的体积比率至少为2:1。5:1左右更好，但一般不超过10:1。
Tris/Glycine SDS - PAGE样品应用缓冲液的条件是: 2% SDS、100mmol/L DTT (取自- 20℃存放的1mol/L贮存液，临用前加入)、60mmo/L Tris ( pH6.8)、0.01% 溴酚蓝和10%甘油。

(2)样品置70℃水浴加热至少5min。除特殊情况外，在凝胶内加样之前不必去除微珠。

至此，电泳样品已准备就绪。
样品既可立即使用也可冻存。-20℃存放的样品可稳定保持数月。

5.常见问题

将免疫沉淀制备的蛋白用于western blot时，来自western blot的抗体会出现在印迹膜上, 该抗体可被二抗试剂检出。通常抗体重链和轻链的大小并不干扰待测抗原的鉴定。然 而，若待测抗原的大小在50kDa或25kDa左右(大约为重链和轻链多肽的大小),有两 种解决办法。一是可将免疫沉淀抗体共价结合在A蛋白或G蛋白微珠上;其二是采用 直接检测技术进行测定。

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