Western Blot实验中为什么选择内参？

答：内参也叫看家基因，在组织或细胞中都会表达，且表达量在不同组织或细胞中几乎是相同的，一般有α-Tublin，β-actin，GAPDH等，在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参。其作用有二:
1. 是看提取蛋白质量的好坏。如果做western的时候，内参照蛋白有条带，而目的蛋白没有，说明蛋白的提取和转膜等步骤没有问题，是目的蛋白的抗体质量不好或者是稀释倍数不对。
2. 是比较客观的说明目的蛋白的表达情况，消除上样量等的误差。不同的样品之间由于蛋白提取的量有差别，可能强阳性的表达跑出来的带很弱。
因此设立内参照，比较不同样品之间的表达情况。

样品要求

答：客户提取新鲜的样品，组织（植物组织、动物组织）、细胞，由钟鼎生物负责提取蛋白。
组织样品：客户提供250-500mg新鲜样品/样
细胞样品：客户提供1×106～1×107细胞/样
以上样品均需要干冰运输。
注：贴壁细胞的处理方法（冰上操作）
1) 转染后的细胞，细胞刮直接刮下来，PBS重悬清洗，吹洗后离心（5000 rpm，4min）去上清-20℃保存，避免反复冻融。
2) 裂解液裂解，裂解后离心（12000 rpm，4min），取上清。

Western Blot实验中为什么检测无信号？（白板）

大概总结为一下几类原因：
（1）样品中目的蛋白丰度很低，低于实验的检测下限
（2）一抗不识别检测物种的蛋白，同时若有阳性参照的话提供阳性对照蛋白，若阳性对照正常则说明抗体及实验参照没有问题，可能是样本中目的蛋白含量比较低。
（3）蛋白降解
（4）待测样品的确为阴性；
（5）一抗失效；
（6）抗原量不足，每泳道蛋白上样量不低于0.1ug

Western Blot实验中为什么检测的结果分子量大小与实际不符？

1. 翻译后修饰—比如蛋白的磷酸化，糖基化等，这些都会增加蛋白的分子量大小。
2.翻译后剪切—比如很多蛋白首先被合成为前体形式，然后通过剪切获得生物学活性
3.剪接变异体—相同的基因，经过选择性剪接会产生不同分子量大小的蛋白。
4.相对电荷—氨基酸的组成 (带电 vs 不带电)
5.多聚体—比如蛋白二聚体。

Western Blot实验中为什么内参条带不一致？

这个是正常现象，理论中样品中内参可以反映总蛋白的含量，内参一致说明上样总蛋白量一致。而理论上，目的蛋白在对应总蛋白中的比例大致相同，所以理论上内参和目的蛋白的比例也在相应组保持一致。同样的，内参不一致的时候，上样总蛋白量相同，但目的蛋白（内参蛋白）在不同样品中提取后的内参蛋白量不一定是完全一致的，所以在进行WB定量分析时会通过内参进行校正分析，最终获得相对的表达量的分析结果。

为什么wb的结果与QPCR结果趋势不一样？

这种情况是比较正常的，WB反映的是蛋白水平的结果，qpcr反映的是基因水平的结果。理论上蛋白水平与基因水平是一致的，但是mRNA的高低不代表其表达蛋白的高低。
也有一些基因可能在组织样品中没有正常翻译，这样即使qpcr检测结果有表达，但是若蛋白没有正常翻译的话，WB则检测不到目的条带。

为什么检测结果有很多杂带？

(1)可能是样品本身体内表达的蛋白具有多种修饰形式如糖基化、磷酸化、乙酰化等；
(2)若是细胞样品，可能是细胞传代次数过多，使其蛋白表达不同，可以使用传达次数少的进行平行实验一起做对照看看。
(3)蛋白降解，导致蛋白分子量降低；
(4)蛋白形成多聚体形式；

为什么WB检测的背景比较高？

(1)可能抗体浓度浓度较高，
(2)抗原量较大。
(3)一张膜中有的目的条带较弱，为了能让较弱条带显示出来，曝光时间较长

转印后膜上蛋白少或者没有

可能原因

(1)凝胶与膜接触不好
(2)目的蛋白被其他高丰度蛋白掩盖，如白蛋白, IgG等

解决方案：

凝胶与膜接触不好

1.确保转印时滤纸，凝胶，膜摆放位置准确并紧密接触无气泡
转印后，膜可以用丽春红染色或者预染marker检查转印效率
转印中使用较厚的专用转印滤纸

目的蛋白被其他高丰度蛋白掩盖，如白蛋白，IgG等

去除这些高丰度蛋白

膜上蛋白条带出现Smile拖尾

可能原因

转热过程中温度过热

解决方案：

对于湿转

1.确保转印槽中buffer没过转印模块
2.Buffer可以预先预冷或者在4度环境下转印
3.如果可能，请使用制冷循环水浴
4.降低转印电流电压，延长转印时间

对于半干转

降低转印电流，不要超过0.8mA/cm²

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