WB，这一简单古老的免疫印迹实验，却也让科研工作者们抓狂不已，谁也不能保证实验的成功。本文将会从实验操作与实验分析两个方面来整理一些western blot实验中的小技巧和心得，来对western blot的过程进行优化，以提高实验的成功率，希望对大家能有所帮助。

实验操作

(1)玻璃板注意一定要洗净，最后用双蒸水冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾上晾干。或者用70%的乙醇擦干，不要留下痕迹量的水。

(2)分离胶建议不要提前配，不能加入AP和TEMED。储存液避光存放于4℃,可至少存放1个月，临用前加入10%AP及TEMED即可。这种储存液中的丙烯酰胺或多或少会降解，胶浓度多多少少会下降。对于浓缩胶来说，可能无伤大雅，但对于分离胶来说就影响较大。虽然标准的实验方案上讲 10%的AP最好现配现用，如在4℃存放勿超过两周，但实验操作时也未必有太大的影响。可以配好较多的10%AP,分装成1.0 mL, -20℃放置，用前取出一管。

(3)灌入分离胶后应立即封胶，胶浓度小于8%时可用0.1%的SDS或水来封胶，浓度大于10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇（有异味，少用），少用0.1%的SDS。封胶后切记勿动。待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及双蒸水冲洗干净，最后用 0.1%SDS洗一次，目的是通过降低张力清除残留水滴。如果用SDS封胶的话，可以不用水洗。将玻璃板倒立放置片刻，或者用滤纸吸掉残余液滴。分离胶不要倒得太满，需要有一定浓缩胶的空间，梳子的孔与分离胶之间应有一定的距离，否则起不到浓缩效果。

(4)灌好浓缩胶一小时后再拔除梳子，特别是室温比较低时胶的凝结比较慢，更急不得；注意在拔除梳子时应边加水边拔，以免有气泡进入梳孔使梳孔变形，或者带着梳子到电流槽，加了电泳跑胶缓冲液后再拔梳子。若上样孔变形，可用适当粗细的针头拨正； 若变形严重，可在去除残胶后用较薄的梳子再次插入梳孔后加水拔出，长时间有利于胶结构的形成。

(5)上样注意平衡一致的原则，加样的时候，没加样品的孔中应加入等量上样缓冲液，避免边缘效应的产生。同时，如果样品中所要分析的蛋白分子量较大，可以采用低电流长时间的方式，尽可能保证样品均一整齐。电泳可采取恒压的方式，低电压过浓缩胶，高电压跑分离胶，但在最后会越来越慢，也可采用恒流的方式，中间不用调电流，跑出来的条带会比较细，如果最后电压升高，胶会越跑越快，一不小心目的蛋白会抛出胶。

(6)转膜前一定要将海绵置于转移缓冲液中泡透。转膜时的温度比较重要，最好保持在10℃一下，可以用冰浴，也可以将转膜系统置于一个大的容器中，外面加入冰水，以确保温度处于低温。最后无论如何，要将海绵泡在热水中，不能让盐离子粘在海绵上，更不能用手去挤海绵中的水。

(7)膜的选择。从结合蛋白的能力看，PVDF膜（100~200μg/cm²)比硝酸纤维膜（80~100μg/cm²)高；就物理强度而言，硝酸纤维素膜较脆，易破碎，而PVDF膜韧性较强；但是硝酸纤维素膜的背景较PVDF膜要低。另外，对于小分子量的蛋白（小于20kDa)一般用0.2μm孔径的膜，而大分子量的蛋白一般用0.45μm孔径的膜。在进行小分子蛋白的分析时，不能按平时通用的转膜条件进行转膜，小分子蛋白极有可能转出膜，通常一个小时就可以。我们曾转反了电极，才15min，大部分预染的蛋白分子标记物就不见了。可见平时的标准实验方案中转膜2h是有点过。

(8)一抗的选择。一抗质量是酶免疫组化、免疫荧光和Western Blot等试验中的最关键因素之一。这部分可以参考《Western Blot中抗体的选择》,一抗订购中选择原则有：选择单克隆还是多克隆抗体，前者特异性好，而后者灵敏度高。
选择何种种属来源？ 一般兔来源的多数是多克隆抗体；而小鼠来源的多是单克隆抗体，但也有例外。这也决定了你的二抗类型。下表简单列举了一下单克隆抗体与多克隆抗体的区别，更多分析可以参考《如何根据实验需求选择单抗和多抗》这篇文章。

	单克隆抗体	多克隆抗体
制备周期	长（5-6个月）	短（2-3个月）
技术要求	高	低
产量	高	低
价格	高	低
对免疫原要求	较高	高
特异性	高	高（抗原亲和纯化）
识别表位	一个	多个
非特异性结合	较少	较多
灵敏度	较高	高
标准化	易，批间差小	较难，批间差大
稳定性	较好	好
凝集反应	大多数没有	有
沉淀反应	大多数没有	有
中和活性	大多数没有	有

(9)二抗的选择。一般有生物素标记、HRP标记和荧光素标记的二抗等多种。一抗种属选择好后，那么二抗只能是某种抗-抗种属来源的抗体，如果是酶免疫组化，则可以选择Bio-或HRP-标记，可以买不同公司单独的抗体，也可购买二抗染色试剂盒，包括二抗、SP等；而免疫荧光则可以选择荧光素标记的二抗。

(10)反复冻融抗体。其效价下降会相当之快。因此，新到的抗体必须要分装，同时，要进行优化。如果实验室以前没人用过，则新到的抗体建议做预实验，摸索一下合适的稀释浓度以及这个抗体的效价怎么样。

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